Reprogramación del adenocarcinoma ductal de páncreas a pluripotencia
Summary
El presente protocolo describe la reprogramación del adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) y las células epiteliales ductales pancreáticas normales en células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Proporcionamos un procedimiento optimizado y detallado, paso a paso, desde la preparación de lentivirus hasta el establecimiento de líneas estables de iPSC.
Abstract
La generación de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) utilizando factores de transcripción se ha logrado a partir de casi cualquier tipo de célula diferenciada y ha demostrado ser muy valiosa para la investigación y las aplicaciones clínicas. Curiosamente, se ha demostrado que la reprogramación iPSC de las células cancerosas, como el adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), revierte el fenotipo invasivo de PDAC y anula el epigenoma del cáncer. La diferenciación de las iPSC derivadas de PDAC puede recapitular la progresión de PDAC a partir de su precursor temprano de la neoplasia intraepitelial pancreática (PanIN), revelando los cambios moleculares y celulares que ocurren temprano durante la progresión de PDAC. Por lo tanto, las iPSC derivadas de PDAC se pueden utilizar para modelar las primeras etapas de PDAC para el descubrimiento de marcadores de diagnóstico de detección temprana. Esto es particularmente importante para los pacientes con PDAC, que generalmente se diagnostican en las etapas metastásicas tardías debido a la falta de biomarcadores confiables para las etapas anteriores de PanIN. Sin embargo, la reprogramación de líneas celulares cancerosas, incluida la PDAC, en pluripotencia sigue siendo un desafío, requiere mucha mano de obra y es muy variable entre las diferentes líneas. Aquí, describimos un protocolo más consistente para generar iPSCs a partir de varias líneas celulares PDAC humanas utilizando vectores lentivirales bicistrónicos. Las líneas de iPSC resultantes son estables, no mostrando dependencia de la expresión exógena de factores de reprogramación o fármacos inducibles. En general, este protocolo facilita la generación de una amplia gama de iPSCs derivadas de PDAC, lo cual es esencial para descubrir biomarcadores tempranos que sean más específicos y representativos de los casos de PDAC.
Introduction
El adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC, por sus siglas en inglés) es una de las neoplasias malignas más mortales, y el diagnóstico precoz sigue siendo un reto debido a la naturaleza asintomática de la enfermedad. La mayoría de los pacientes con PDAC son diagnosticados en el estadio metastásico avanzado, cuando se dispone de opciones de tratamiento muy limitadas 1,2. Esto se debe principalmente a la falta de biomarcadores fiables para las primeras etapas, como los que podrían detectarse convenientemente como proteínas liberadas en el torrente sanguíneo.
El PDAC puede diseminarse muy temprano durante su progresión, y un mejor pronóstico se ha relacionado con la detección temprana del cáncer cuando el PDAC se localiza en el páncreas3. Sin embargo, menos de una décima parte de los pacientes con PDAC son diagnosticados con un pronóstico favorable, lo que permite la resección quirúrgica. No obstante, los pocos con tumores resecables también son propensos a la recurrencia tumoral dentro de los 12 meses4.
En las últimas cinco décadas, se han logrado mejoras notables en las técnicas quirúrgicas, la atención al paciente y las modalidades de tratamiento 5,6. Sin embargo, la tasa de supervivencia a 5 años en pacientes con PDAC resecados quirúrgicamente apenas ha aumentado al 17%. Sin embargo, sigue siendo mejor que la de los pacientes no resecados, que se ha mantenido casi sin cambios (0,9%)4,7. La quimioterapia es el único otro tratamiento alternativo para el PDAC. Sin embargo, esta opción es muy limitada, ya que la gran mayoría de los pacientes con PDAC presentan una fuerte resistencia a los medicamentos quimioterápicos como la gemcitabina 7,8. Otros fármacos, como el erlotinib, solo están disponibles para un pequeño grupo de pacientes con PDAC con mutaciones específicas, la mayoría de los cuales muestran resistencia al erlotinib9. Los efectos secundarios adversos asociados a la quimioterapia en la mayoría de los pacientes con PDAC son otra desventaja de este tratamiento10. Recientemente, estrategias prometedoras han demostrado que los inhibidores de puntos de control inmunitario (ICI) y los inhibidores de la quinasa de molécula pequeña (SMKI) pueden ser eficaces en el tratamiento de la PDAC, pero las respuestas duraderas a estas terapias dirigidas siguen estando limitadas a una minoría de pacientes11,12. En general, el descubrimiento de biomarcadores tempranos específicos de PDAC puede allanar nuevas vías para el diagnóstico y el tratamiento tempranos.
El PDAC se desarrolla a partir de lesiones precursoras de neoplasias intraepiteliales pancreáticas (PanIN) que resultan de proliferaciones epiteliales no invasivas del conducto pancreático13,14. Si bien la formación de PanIN se inicia por mutaciones oncogénicas como KRAS, se requieren alteraciones genéticas y epigenéticas adicionales para la progresión a PDAC. Se ha proyectado que la progresión de la PanIN a través de las diferentes etapas hasta el PDAC invasivo tarda unos 10 años 13,15,16,17. Este período de tiempo ofrece una gran oportunidad para beneficiarse del diagnóstico precoz de PDAC. Por lo tanto, se ha llevado a cabo una amplia investigación para establecer modelos animales de xenoinjertos tumorales y cultivos de organoides para estudiar la progresión de PDAC 18,19,20,21. Estos modelos han sido muy útiles para estudiar las etapas invasivas de PDAC, aunque no la transición de las fases tempranas de PanIN. Por lo tanto, es importante desarrollar modelos experimentales que puedan recapitular la progresión temprana de las etapas de PanIN para permitir el descubrimiento de biomarcadores de detección temprana.
La reprogramación de células somáticas en células madre pluripotentes inducidas (iPSC) utilizando los cuatro factores de transcripción OCT4, SOX2, KLF4 y c-MYC (OSKM) ha ilustrado el alcance de la plasticidad celular22. La plasticidad de las células cancerosas ha sido bien documentada, y la reprogramación de células cancerosas humanas en iPSC se ha utilizado con éxito para restablecer las células a su estado celular original, eliminando muchas de las agresiones epigenéticas que se han acumulado durante la progresión del cáncer 23,24,25,26,27,28,29. Por lo tanto, la posibilidad de utilizar esta estrategia de reprogramación para manipular la identidad de las células cancerosas ha sido muy prometedora en el tratamiento del cáncer30,31. De hecho, hemos demostrado previamente que la diferenciación de las iPSCs derivadas de las PDACs puede recapitular la progresión de las PDAC a través de las primeras etapas de PanIN32. Mediante la identificación de genes y vías específicas de las etapas tempranas e intermedias del PDAC, se identificaron biomarcadores candidatos que pueden ser utilizados clínicamente para el diagnóstico precoz del PDAC32,33. Sin embargo, los biomarcadores descubiertos utilizando una sola línea de iPSC mostraron una cobertura limitada en la mayoría de los pacientes con PDAC32. Los desafíos de generar líneas de iPSC a partir de otros pacientes con PDAC han detenido la capacidad de descubrir biomarcadores más confiables. Esto se debe a muchos factores técnicos, incluida la heterogeneidad de la administración de OSKM, ya que solo una pequeña parte de las células PDAC primarias humanas contenían los cuatro factores y respondieron con éxito a la reprogramación. Aquí, se presenta un protocolo detallado para la reprogramación de células PDAC primarias utilizando una administración lentiviral dual más eficiente y consistente de OSKM.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con el fin de facilitar el uso de la reprogramación de iPSC para estudiar la progresión del cáncer, se ha establecido un protocolo sólido para la reprogramación de células de cáncer de páncreas. La reprogramación de las células cancerosas en pluripotencia ha demostrado ser muy difícil hasta ahora, ya que solo unos pocos estudios han generado con éxito iPSC a partir de células cancerosas 32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46 <sup…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.S y J.K desean agradecer a Cancer Research UK y OHSU por su financiación (Premio al proyecto CRUK-OHSU C65925/A26986). A.S cuenta con el apoyo de un premio de desarrollo profesional del MRC (MR/N024028/1). A.A está financiado por una beca de doctorado (Beca ref. 1078107040) de la Ciudad Rey Abdulaziz para la Ciencia y la Tecnología. J.K está financiado por la Subvención para Nuevos Investigadores de MRF (GCNCR1042A) y la Subvención Knight CEDAR (68182-933-000, 68182-939-000). Agradecemos al Prof. Keisuke Kaji por proporcionar amablemente el vector de reprogramación pSIN4-EF1a-O2S y pSIN4-CMV-K2M. A los efectos del acceso abierto, el autor ha aplicado una licencia Creative Commons Attribution (CC BY) a cualquier versión del Manuscrito Aceptado por el Autor que surja de esta presentación.
Materials
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Thermo Fisher | 31350010 |
| Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-R | BioLegend | 330613 |
| Bovine Pituitary Extract (BPE) | Thermo Fisher | 13028014 |
| BxPc3 | ATCC | CRL-1687 |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Merck | C8052-1MG |
| Collagen, Type I solution from rat tail | Merck | C3867 |
| Completed Defined K-SFM | Thermo Fisher | 10744-019 |
| Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates | Merck | CLS3516 |
| Corning syringe filters | Merck | CLS431231 |
| Corning tissue-culture treated culture dishes | Merck | CLS430599 |
| Day Impex Virkon Disinfectant Virucidal Tablets | Thermo Fisher | 12328667 |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | D8537 |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo Fisher | 10270-106 |
| Fugene HD Transfection Reagent | Promega | E2312 |
| Gelatin solution, Type B, 2% in H2O | Merck | G1393-100ML |
| Glasgow Minimum Essential Media (GMEM) | Merck | G5154 |
| Human EGF Recombinant Protein | Thermo Fisher | PHG0311 |
| Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) Recombinant Protein, PeproTech | Thermo Fisher | 100-18B |
| Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line (H6c7) | Kerafast | ECA001-FP |
| iMEF feeder cells | iXcells Biotechnologies | 10MU-001-1V |
| Keratinocyte Serum Free Media (KSFM) | Thermo Fisher | 17005-042 |
| KnockOut DMEM | Thermo Fisher | 10829018 |
| KnockOut serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030-024 |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140050 |
| Millex-HP 0.45 μM syringe Filter Unit (Sterile) | Merck | SLHP033RS |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 |
| pMDG | AddGene | 187440 |
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Merck | H9268-5G |
| pSIN4-CMV-K2M | AddGene | 21164 |
| pSIN4-EF2-O2S | AddGene | 21162 |
| psPAX2 | AddGene | 12260 |
| pWPT-GFP | AddGene | 12255 |
| RPMI 1640 Medium (ATCC modification) | Thermo Fisher | A1049101 |
| Sodym Pyruvate | Thermo Fisher | 11360-039 |
| Sterile Syringes for Single Use (60 mL) | Thermo Fisher | 15899152 |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher | 12605036 |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | 72304 |
Riferimenti
- Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: the unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the United States. Ricerca sul cancro. 74 (11), 2913-2921 (2014).
- Hu, J. X., et al. Pancreatic cancer: A review of epidemiology, trend, and risk factors. World Journal of Gastroenterology. 27 (27), 4298 (2021).
- Howlader, N., et al. SEER cancer statistics review, 1975-2013. National Cancer Institute. 19, (2016).
- Bengtsson, A., Andersson, R., Ansari, D. The actual 5-year survivors of pancreatic ductal adenocarcinoma based on real-world data. Scientific Reports. 10 (1), 16425 (2020).
- He, J., et al. 2564 resected periampullary adenocarcinomas at a single institution: trends over three decades. HPB. 16 (1), 83-90 (2014).
- Dusch, N., et al. Factors predicting long-term survival following pancreatic resection for ductal adenocarcinoma of the pancreas: 40 years of experience. Journal of Gastrointestinal Surgery. 18 (4), 674-681 (2014).
- Principe, D. R., et al. The current treatment paradigm for pancreatic ductal adenocarcinoma and barriers to therapeutic efficacy. Frontiers in Oncology. 11, 688377 (2021).
- Papademetrio, D. L., et al. Interplay between autophagy and apoptosis in pancreatic tumors in response to gemcitabine. Targeted Oncology. 9 (2), 123-134 (2014).
- Ng, S. S., Tsao, M. S., Nicklee, T., Hedley, D. W. Effects of the epidermal growth factor receptor inhibitor OSI-774, Tarceva, on downstream signaling pathways and apoptosis in human pancreatic adenocarcinoma 1 supported by the National Cancer Institute of Canada and the Pat Myhal Fund for Pancreatic Cancer Research. Molecular Cancer Therapeutics. 1 (10), 777-783 (2002).
- Sultana, A., et al. Meta-analyses of chemotherapy for locally advanced and metastatic pancreatic cancer. Journal of Clinical Oncology. 25 (18), 2607-2615 (2007).
- Sun, J., Russell, C. C., Scarlett, C. J., McCluskey, A. Small molecule inhibitors in pancreatic cancer. RSC Medicinal Chemistry. 11 (2), 164-183 (2020).
- Jiang, H., et al. Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy. Nature Medicine. 22 (8), 851-860 (2016).
- Hruban, R. H., et al. Pancreatic intraepithelial neoplasia: a new nomenclature and classification system for pancreatic duct lesions. The American Journal of Surgical Pathology. 25 (5), 579-586 (2001).
- Maitra, A., Hruban, R. H. Pancreatic cancer. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 3, 157-188 (2008).
- Vincent, A., Herman, J., Schulick, R., Hruban, R. H., Goggins, M. Pancreatic cancer. The Lancet. 378 (9791), 607-620 (2011).
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Lennon, A. M., et al. The early detection of pancreatic cancer: what will it take to diagnose and treat curable pancreatic neoplasia. Ricerca sul cancro. 74 (13), 3381-3389 (2014).
- Rubio-Viqueira, B., et al. An in vivo platform for translational drug development in pancreatic cancer. Clinical Cancer Research. 12 (15), 4652-4661 (2006).
- Li, C., et al. Identification of pancreatic cancer stem cells. Ricerca sul cancro. 67 (3), 1030-1037 (2007).
- Hermann, P. C., et al. Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer. Cell Stem Cell. 1 (3), 313-323 (2007).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Suvà, M. L., et al. Reconstructing and reprogramming the tumor-propagating potential of glioblastoma stem-like cells. Cell. 157, 580-594 (2014).
- Kotini, A. G., et al. Stage-specific human induced pluripotent stem cells map the progression of myeloid transformation to transplantable leukemia. Cell Stem Cell. 20 (3), 315-328 (2017).
- Stricker, S. H., et al. Widespread resetting of DNA methylation in glioblastoma-initiating cells suppresses malignant cellular behavior in a lineage-dependent manner. Genes Development. 27 (6), 654-669 (2013).
- Chao, M. P., et al. Human AML-iPSCs reacquire leukemic properties after differentiation and model clonal variation of disease. Cell Stem Cell. 20 (3), 329-344 (2017).
- Aparicio, L. A., et al. Clinical implications of epithelial cell plasticity in cancer progression. Cancer letters. 366 (1), 1-10 (2015).
- Grimont, A., Leach, S. D., Chandwani, R. Uncertain beginnings: acinar and ductal cell plasticity in the development of pancreatic cancer. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 13 (2), 369-382 (2022).
- Greenspan, L. J., Weinstein, B. M. To be or not to be: endothelial cell plasticity in development, repair, and disease. Angiogenesis. 24 (2), 251-269 (2021).
- Papapetrou, E. P. Patient-derived induced pluripotent stem cells in cancer research and precision oncology. Nature Medicine. 22 (12), 1392-1401 (2016).
- Zhang, X., Cruz, F. D., Terry, M., Remotti, F., Matushansky, I. Terminal differentiation and loss of tumorigenicity of human cancers via pluripotency-based reprogramming. Oncogene. 32 (18), 2249-2260 (2013).
- Kim, J., et al. An iPSC line from human pancreatic ductal adenocarcinoma undergoes early to invasive stages of pancreatic cancer progression. Cell Reports. 3 (6), 2088-2099 (2013).
- Kim, J., et al. Detection of early pancreatic ductal adenocarcinoma with thrombospondin-2 and CA19-9 blood markers. Science Translational Medicine. 9 (398), (2017).
- Susac, L., et al. Structure of a fully assembled tumor-specific T cell receptor ligated by pMHC. Cell. 185 (17), 3201-3213 (2022).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Carette, J. E., et al. Generation of iPSCs from cultured human malignant cells. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 115 (20), 4039-4042 (2010).
- Choi, S. M., et al. Reprogramming of EBV-immortalized B-lymphocyte cell lines into induced pluripotent stem cells. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 118 (7), 1801-1805 (2011).
- Hochedlinger, K., et al. Reprogramming of a melanoma genome by nuclear transplantation. Genes & Development. 18 (15), 1875-1885 (2004).
- Hu, K., et al. Efficient generation of transgene-free induced pluripotent stem cells from normal and neoplastic bone marrow and cord blood mononuclear cells. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 117 (14), e109-e119 (2011).
- Iskender, B., Izgi, K., Canatan, H. Reprogramming bladder cancer cells for studying cancer initiation and progression. Tumor Biology. 37, 13237-13245 (2016).
- Khoshchehreh, R., et al. Epigenetic reprogramming of primary pancreatic cancer cells counteracts their in vivo tumourigenicity. Oncogene. 38 (34), 6226-6239 (2019).
- Kim, H. J., et al. Establishment of hepatocellular cancer induced pluripotent stem cells using a reprogramming technique. Gut and Liver. 11 (2), 261 (2017).
- Lin, S. L., et al. Mir-302 reprograms human skin cancer cells into a pluripotent ES-cell-like state. RNA. 14 (10), 2115-2124 (2008).
- Miyoshi, N., et al. Defined factors induce reprogramming of gastrointestinal cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (1), 40-45 (2010).
- Singovski, G., et al. In vivo epigenetic reprogramming of primary human colon cancer cells enhances metastases. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (2), 157-173 (2016).
- Zhao, H., et al. A highly optimized protocol for reprogramming cancer cells to pluripotency using nonviral plasmid vectors. Cellular Reprogramming (Formerly" Cloning and Stem Cells". 17 (1), 7-18 (2015).
- Lo, C. A., et al. Quantification of protein levels in single living cells). Cell Reports. 13 (11), 2634-2644 (2015).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
- Prösch, S., et al. Inactivation of the very strong HCMV immediate early promoter by DNA CpG methylation in vitro. Biological Chemistry Hoppe-Seyler. 377 (3), 195-201 (1996).
- Mehta, A. K., Majumdar, S. S., Alam, P., Gulati, N., Brahmachari, V. Epigenetic regulation of cytomegalovirus major immediate-early promoter activity in transgenic mice. Gene. 428 (1-2), 20-24 (2009).
- Chen, X., et al. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells. Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).
- Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells. Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).
- Chronis, C., et al. Cooperative binding of transcription factors orchestrates reprogramming. Cell. 168 (3), 442-459 (2017).
- Li, D., et al. Chromatin accessibility dynamics during iPSC reprogramming. Cell Stem Cell. 21 (6), 819-833 (2017).
- Soufi, A., Donahue, G., Zaret, K. S. Facilitators and impediments of the pluripotency reprogramming factors’ initial engagement with the genome. Cell. 151 (5), 994-1004 (2012).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 157-162 (2009).
