इम्यूनोफ्लोरोसेंट इमेजिंग समय में केवल एक स्नैपशॉट में जटिल, समय-निर्भर जैविक प्रक्रियाओं का निरीक्षण करने की क्षमता से विवश है। यह अध्ययन सटीक-कट माउस सबमांडिबुलर ग्रंथि स्लाइस पर आयोजित एक लाइव-इमेजिंग दृष्टिकोण की रूपरेखा तैयार करता है। यह दृष्टिकोण होमियोस्टेसिस के दौरान सेल-सेल इंटरैक्शन के वास्तविक समय के अवलोकन और पुनर्जनन और मरम्मत की प्रक्रियाओं की अनुमति देता है।
लार ग्रंथि पुनर्जनन एक जटिल प्रक्रिया है जिसमें विभिन्न सेल प्रकारों के बीच जटिल बातचीत शामिल है। हाल के अध्ययनों ने पुनर्योजी प्रतिक्रिया को चलाने में मैक्रोफेज द्वारा निभाई गई महत्वपूर्ण भूमिका पर प्रकाश डाला है। हालांकि, इस महत्वपूर्ण भूमिका की हमारी समझ मुख्य रूप से निश्चित ऊतक बायोप्सी से प्राप्त स्थिर विचारों पर निर्भर है। इस सीमा को दूर करने और वास्तविक समय में इन इंटरैक्शन में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए, यह अध्ययन लार ग्रंथि ऊतक पूर्व विवो संवर्धन और सेल प्रवास की लाइव छवियों पर कब्जा करने के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार करता है।
प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं: सबसे पहले, माउस सबमांडिबुलर लार ग्रंथि ऊतक को ध्यान से एक वाइब्रेटोम का उपयोग करके कटा हुआ है और फिर एक वायु-तरल इंटरफ़ेस पर सुसंस्कृत किया जाता है। इन स्लाइस जानबूझकर घायल हो सकता है, उदाहरण के लिए, विकिरण के संपर्क के माध्यम से, सेलुलर क्षति प्रेरित करने और पुनर्योजी प्रतिक्रिया को ट्रिगर करने के लिए. ब्याज की विशिष्ट कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए, वे अंतर्जात लेबल किया जा सकता है, इस तरह के आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों से एकत्र लार ग्रंथि ऊतक का उपयोग करके जहां एक विशेष प्रोटीन हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के साथ चिह्नित है. वैकल्पिक रूप से, फ्लोरोसेंटली-संयुग्मित एंटीबॉडी को ब्याज के विशिष्ट सेल सतह मार्करों को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को दागने के लिए नियोजित किया जा सकता है। एक बार तैयार होने के बाद, लार ग्रंथि स्लाइस 12 घंटे की अवधि में एक उच्च सामग्री confocal इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर लाइव इमेजिंग के अधीन हैं, छवियों 15 मिनट के अंतराल पर कब्जा कर लिया. परिणामी छवियों को तब एक फिल्म बनाने के लिए संकलित किया जाता है, जिसे बाद में मूल्यवान सेल व्यवहार मापदंडों को निकालने के लिए विश्लेषण किया जा सकता है। यह अभिनव विधि शोधकर्ताओं को चोट के बाद लार ग्रंथि के भीतर मैक्रोफेज इंटरैक्शन की जांच करने और बेहतर ढंग से समझने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करती है, जिससे इस गतिशील जैविक संदर्भ में खेलने पर पुनर्योजी प्रक्रियाओं के बारे में हमारे ज्ञान को आगे बढ़ाया जा सके।
मैक्रोफेज को पुनर्जनन और मरम्मत की प्रक्रियाओं में तेजी से महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है, जो उनके शास्त्रीय प्रतिरक्षा समारोह 1,2 से परे है। दरअसल, मैक्रोफेज पुनर्जनन से संबंधित प्रक्रियाओं की अधिकता में शामिल हैं, मरम्मत के सभी चरणों में महत्वपूर्ण नियामक गतिविधि का प्रदर्शन, साथ ही निशान गठन और फाइब्रोसिस 3,4. ऊतक-निवासी मैक्रोफेज विभिन्न सेलुलर फेनोटाइप चलाने वाले जटिल तंत्र के साथ अत्यधिक विषम सेल प्रकार हैं, और वे अंग विकास, कार्य और होमियोस्टेसिस में आवश्यक भूमिका निभाते हैं (जैसा कि5 में समीक्षा की गई है)। ऊतक-निवासी मैक्रोफेज शुरू में जर्दी थैली और भ्रूण यकृत में अग्रदूतों से उत्पन्न होते हैं, और बाद में उन्हें मौजूदा मैक्रोफेज की दीर्घायु और ऊतक या आला के आधार पर अलग-अलग दरों पर प्रसार या अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न रक्त मोनोसाइट्स द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है, जिसके भीतर वेरहते हैं 6,7.
महत्वपूर्ण रूप से, ऊतक-निवासी मैक्रोफेज सभी ऊतकों में फैले हुए हैं और विविध अंग कार्यों में योगदान करते हैं। वे विशिष्ट विशिष्ट कार्यों को करने के लिए अपने माइक्रोएन्वायरमेंट द्वारा विशिष्ट रूप से प्रोग्राम किए जाते हैं। इस कारण से, ऊतक के भीतर मैक्रोफेज का स्थानीयकरण उनके कार्य में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, फेफड़े, स्तन ग्रंथि, आंत, त्वचा और मांसपेशियों में देखी गई अद्वितीय आबादी के साथ 8,9,10. स्तन ग्रंथि के विकास के दौरान, डक्टल मैक्रोफेज अंतरंग डक्टल पेड़ के साथ जुड़े हुए हैं, और उनकी कमी के परिणामस्वरूप काफी कम शाखाओं में11. इसके अलावा, गर्भावस्था में यौवन और एल्वोलोजेनेसिस के दौरान मॉर्फोजेनेसिस के लिए मैक्रोफेज की आवश्यकता होती है, जहां वे सक्रिय रूप से उपकला की निगरानी करते हैं। मांसपेशियों की चोट में, मैक्रोफेज की एक विशिष्ट आबादी चोट स्थल के भीतर “रहती है”, एक क्षणिक जगह प्रदान करती है जिसमें वे स्टेम सेल प्रसार के लिए आवश्यक प्रसार-प्रेरित संकेतों की आपूर्ति करते हैं। इस प्रकार, वे मरम्मत प्रक्रिया2 को नियंत्रित करने में विशिष्ट मैक्रोफेज आबादी की विशेष भूमिका प्रदर्शित करते हैं। फेफड़े में, एक समान घटना होती है जहां आईएल -1 बी 12 की रिहाई के माध्यम से क्षति से जुड़े क्षणिक पूर्वज में रूपांतरण के लिए अंतरालीय मैक्रोफेज प्राइम इंटरल्यूकिन (आईएल) -आर1-व्यक्त वायुकोशीय प्रकार II (एटी 2) कोशिकाएं। इसके अलावा, हाल के शोध से पता चला है कि मैक्रोफेज विकिरण चोट के बाद माउस submandibular लार ग्रंथि (एसएमजी) के उत्थान के लिए आवश्यक हैं, और उनकी अनुपस्थिति में, उपकला उत्थान13 बाधित है. एक साथ लिया गया, यह डेटा ऊतक की चोट के बाद क्षणिक भड़काऊ निशानों में मैक्रोफेज सक्रियण और कार्य के महत्व पर प्रकाश डालता है, साथ ही होमियोस्टेसिस के दौरान भी।
मैक्रोफेज सक्रिय कोशिकाएं हैं, और उनके कार्यों में प्रत्यक्ष सेल-सेल संपर्क14,15, साथ ही घुलनशील कारकों 2,16 के स्राव जैसे अधिक अप्रत्यक्ष तरीकों सहित विभिन्न प्रकार के सेल प्रकारों के साथ बातचीत शामिल है, जो आला विनियमन के लिए आवश्यक हैं। शास्त्रीय immunofluorescent इमेजिंग इन बातचीत को सुलझाना शुरू करने के लिए उपयोगी है, यह समय में केवल एक स्नैपशॉट चित्रण द्वारा सीमित है, जिससे एक अत्यधिक गतिशील पुनर्योजी प्रक्रिया17,18 के लिए महत्वपूर्ण कई timepoints छोड़ने. चूंकि समय का महत्व और उत्थान की विभिन्न तरंगों का उद्भव तेज ध्यान में आता है, इसलिए इन प्रक्रियाओं को अधिक विस्तार से विच्छेदित करना आवश्यक है।
रेडियोथेरेपी कैंसर से पीड़ित कई लोगों के लिए एक जीवन रक्षक उपचार है। जबकि अक्सर ट्यूमर (ओं) को सिकोड़ने या खत्म करने में प्रभावी होता है, रेडियोथेरेपी विकिरण क्षेत्र में पड़े स्वस्थ ऊतकों को भी नुकसान पहुंचा सकती है और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्राप्त कर सकती है। विकिरण चोट तेजी से मैक्रोफेज भर्ती, और प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष immunomodulatory प्रतिक्रियाओं19,20 प्रेरित कर सकते हैं. लार ग्रंथियों अक्सर अनजाने में सिर और गर्दन के कैंसर21,22 के लिए उपचार के दौरान विकिरणित कर रहे हैं, उपकला क्षति, सेल शोष, और फाइब्रोसिस23,24, xerostomia या पुरानी शुष्क मुंह25 में जिसके परिणामस्वरूप.
लार ग्रंथि सेल प्रकार और संरचनाओं की अधिकता से बना है, जिसमें उपकला कोशिकाओं (लार-उत्पादक एसिनार कोशिकाओं और लार-परिवहन डक्टल कोशिकाओं दोनों), मायोपीथेलियल कोशिकाओं, उपकला पूर्वज कोशिकाओं, नसों, रक्त वाहिकाओं, प्रतिरक्षा कोशिकाओं, फाइब्रोब्लास्ट्स, और बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) शामिल हैं, लेकिन इन्हीं तक सीमित नहीं हैं। पुनर्योजी प्रतिक्रिया में इन सेल प्रकारों में से कई की भूमिका और प्रतिक्रिया पहले 26,27,28,29,30 वर्णित की गई है। हालांकि, ये विभिन्न कोशिकाएं होमियोस्टैसिस और पुनर्जनन के दौरान कैसे बातचीत करती हैं, और विशेष रूप से मैक्रोफेज जैसी प्रतिरक्षा कोशिकाएं कैसे व्यवहार करती हैं, इसका कम अच्छी तरह से अध्ययन किया जाता है। यह पांडुलिपि एसएमजी मैक्रोफेज और पूर्व विवो ऊतक में ब्याज की अन्य कोशिकाओं के बीच लाइव इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक नई स्थापित विधि का वर्णन करती है। एसएमजी को एक वाइब्रेटोम पर काटा जाता है, सतह मार्करों के लिए दाग दिया जाता है, और 12 घंटे तक इमेज किया जाता है। इस पद्धति का उपयोग करके, मैक्रोफेज द्वारा आसपास की कोशिकाओं के फागोसाइटोसिस को देखा जा सकता है, मैक्रोफेज माइग्रेशन कैनेटीक्स का अध्ययन किया जा सकता है, और मैक्रोफेज और उपकला कोशिकाओं के बीच प्रत्यक्ष सेल-सेल इंटरैक्शन का प्रदर्शन किया जा सकता है।
लार ग्रंथि ऊतक पूर्व विवो संस्कृति करने की क्षमता दोनों homeostasis और चोट प्रतिक्रिया के संदर्भ में सेल सेल बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट अवसर प्रस्तुत करता है. हालांकि माउस submandibular ग्रंथि के intravital इमेजिंग39,40 संभव है, इस तकनीक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर माउस मॉडल का उपयोग करने पर निर्भर करता है अंतर्जात ब्याज की कोशिकाओं लेबल और टर्मिनल संज्ञाहरण के तहत किया जाना चाहिए. यहाँ, संस्कृति submandibular ग्रंथि स्लाइस पूर्व vivo के लिए एक विधि का वर्णन किया है, सेलुलर वास्तुकला और सेल सेल बातचीत को बनाए रखने. यह दृष्टिकोण वर्तमान लाइव इमेजिंग तकनीकों को परिष्कृत करता है और इंट्राविटल इमेजिंग का विकल्प प्रदान करता है।
इस तकनीक का उपयोग ऊतक के दीर्घकालिक रखरखाव एक हवा तरल इंटरफेस पर संवर्धन स्लाइस पर निर्भर करता है. पिछले एक्सप्लांट मॉडल 26,41 ने केवल कुछ दिनों के लिए सफल संस्कृति हासिल की है क्योंकि वे मीडिया में डूबे हुए थे और अनिवार्य रूप से “घुटन” थे। इसके विपरीत, एक वायु-तरल इंटरफ़ेस संस्कृति प्रणाली का उपयोग एक विस्तारित अवधि के लिए ऊतक स्वास्थ्य और संरचना को बनाए रखता है, उच्च गुणवत्ता वाली इमेजिंग सुनिश्चित करता है। इमेजिंग से पहले एसएमजी स्लाइस बढ़ते की विधि, मीडिया की एक छोटी राशि के साथ और टुकड़ा फ्लैट रखने के लिए एक अंतरिक्ष प्रतिबंधित कक्ष के भीतर, तकनीक की सफलता के लिए अभिन्न अंग है. इस परख में कोशिकाओं के दृश्य अंतर्जात लेबल रिपोर्टर चूहों या fluorescently संयुग्मित एंटीबॉडी पर निर्भर करता है. ट्रांसजेनिक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर माउस मॉडल और विशिष्ट सेल प्रकारों और सबसेट को लक्षित करने वाले संयुग्मित एंटीबॉडी की प्रचुरता इस विधि को विभिन्न सेल-विशिष्ट इंटरैक्शन की खोज के लिए उपयुक्त बनाती है।
जबकि यह विधि सीटू में ऊतक का एक अच्छा मॉडल प्रदान करती है और पूर्व विवो विकिरण चोट के परिणामस्वरूप एसिनार और डक्टल स्ट्रक्चर शोष होता है, जो विवो13 में होता है, कुछ तत्वों को पूर्व विवो में पुन: प्रस्तुत नहीं किया जा सकता है। इनमें कार्यशील वास्कुलचर और न्यूरोनल इनपुट की कमी, साथ ही घुसपैठ करने वाली भड़काऊ कोशिकाओं की अनुपस्थिति शामिल है। लार ग्रंथि homeostasis और उत्थान 26,42 में रक्त वाहिकाओं और नसों की अच्छी तरह से प्रलेखित भूमिका और लार ग्रंथि समारोह में टी और बी कोशिकाओं के रूप में टी और बी कोशिकाओं के रूप में प्रवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं43, के महत्व को देखते हुए, चोट प्रतिक्रिया, संक्रमण, और Sjögren सिंड्रोम (एसएस) रोगजनन (44 में समीक्षा के रूप में), इस परख कुछ महत्वपूर्ण सेलुलर बातचीत याद कर सकते हैं. इसके अतिरिक्त, बहुत तेजी से प्रवासी घटनाओं, जैसे प्राकृतिक हत्यारा (एनके) सेल45 और डेंड्राइटिक सेल (डीसी)46 आंदोलन, हर 15 मिनट इमेजिंग द्वारा याद किया जा सकता है। हालांकि, इमेजिंग अंतराल ब्याज की विशिष्ट सेल बातचीत का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, और जेड ढेर के माध्यम से 3 आयामों में छवि करने की क्षमता 3 डी सेल आंदोलन के आकलन की अनुमति देता है. इमेजिंग के दौरान ऊतक को सुरक्षित रूप से बढ़ते हुए मात्रा का ठहराव के लिए महत्वपूर्ण है, जैसे सेल ट्रैकिंग माप। इसके अलावा, हालांकि इस अध्ययन माउस ऊतक का उपयोग किया, प्रोटोकॉल मानव लार ग्रंथियों में सेल सेल बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक व्यवहार्य विधि प्रदान करता है, अन्य तरीकों के माध्यम से अप्राप्य मूल्यवान अनुवाद संबंधी जानकारी उत्पन्न.
जबकि होमियोस्टेसिस और पुनर्जनन में ऊतक-निवासी मैक्रोफेज की भूमिका कई ऊतकों 2,10,11,12में प्रदर्शित की गई है, लार ग्रंथियों में उनकी भूमिका काफी हद तक अनुत्तरित है। हालांकि यह ज्ञात है कि मैक्रोफेज विकिरण चोट13 के बाद उपकला उत्थान के लिए आवश्यक हैं, इस प्रभाव अंतर्निहित सटीक तंत्र अज्ञात रहते हैं. लार ग्रंथि स्लाइस के लाइव इमेजिंग वास्तविक समय दृश्य और जटिल ऊतक गतिशीलता, जो अक्सर पारंपरिक फोकल इमेजिंग द्वारा याद किया जाता है के विश्लेषण सक्षम बनाता है. इसके अतिरिक्त, यह स्पष्ट है कि मैक्रोफेज विवो47,48,49 में विभिन्न कार्यों का प्रदर्शन करते हुए आकार में गतिशील परिवर्तन से गुजरते हैं, और यह प्रोटोकॉल संभवतः निश्चित ऊतक में एक विशिष्ट स्थिर दृश्य की तुलना में इन परिवर्तनों का बेहतर प्रतिनिधित्व प्रदान करता है। भविष्य के अध्ययन इस तकनीक का उपयोग यह जांचने के लिए कर सकते हैं कि होमियोस्टेसिस, चोट और पुनर्जनन / संकल्प के दौरान सेल-सेल संचार कैसे बदलता है। यह दृष्टिकोण प्रमुख सिग्नलिंग मार्गों और घटनाओं को स्पष्ट करने के लिए उपयोगी होगा जो अंततः चिकित्सीय लाभ प्रदान कर सकते हैं।
The authors have nothing to disclose.
एसई को वेलकम ट्रस्ट अनुदान 108906/जेड/15/जेड द्वारा वित्त पोषित किया जाता है; EE को UKRI/MRC अनुदान MR/S005544/1 और एडिनबर्ग विश्वविद्यालय से चांसलर फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। चित्रा 1 ए BioRender.com के साथ बनाया गया है।
0.4 µm filter cell culture inserts (Nunc) | Avantor/VWR | 734-2240 | Inserts pre-packed in 6-well multidishes, 20 mm × 25 mm |
24 well plate | Corning | 3524 | |
35 mm dish | Falcon | 353001 | |
6 well plate | Corning | 3516 | |
Coverslips | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 111650 | Deckglaser Cover Glasses 25 mm diameter |
Double-sided sticker | Grace Bio-Labs | 654004 | SecureSeal Imaging Spacers SS1 x 13, 13 mm diameter x 0.12 mm depth, 25 mm x 25mm OD |
EtOH | Scientific Laboratories Supplies | CHE1924 | Absolute ethanol (EtOH) AR, 99.7% |
F4/80 antibody | Invitrogen | 17-4801-82 | F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), APC, eBioscience |
Forceps | Fine Science Tools | 91113-10 | Student Fine Forceps Straight Broad Shanks |
Glass bottom 6 well plate | Cellvis | P06-1.5H-N | 6 well glass bottom plate with high performance #1.5 cover glass |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14025050 | +calcium +magnesium, no phenol red |
Hoechst | Sigma Aldrich | 14533 | Alternative name: bisBenzimide H 33342 trihydrochloride |
Ice box | Fisher Scientific | 11339623 | Azlon Polyurethane Ice Buckets with Lid |
Imaging and analysis software | Harmony | ||
Low Melting Agarose | Merck | A9414-25G | |
Paintbrush | Watercolour brush, 10 mm x 2mm tip | ||
Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, 0.1 μm filtered |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 20012027 | |
RPMI | ThermoFisher | 12634010 | Gibco Advanced DMEM/F-12 |
Scalpel | Swann-Morton | Disposable scalpels, No. 11 blade | |
Scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | Extra Narrow Scissors 10.5 cm |
Shepherd Mark-I-68A 137Cs irradiator | JL Shepherd & Associates | ||
Superglue | Bostik | Multi-purpose superglue, fast setting, ultra strong | |
Vibratome | Leica | Leica VT 1000 S | |
Vibratome blades | Astra | Superior Platinum Double Edge blade | |
Wild-type (C57BL/BJ) mice | Charles River |