JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Biologia

Utvikling av multiplekse sanntids RT-qPCR-analyser for påvisning av SARS-CoV-2, influensa A/B og MERS-CoV

Published: November 10, 2023
doi:
10.3791/65822
, , , , , ,
1Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE),King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

Summary

Vi presenterer to sondebaserte interne ett-trinns RT-qPCR-sett for vanlige luftveisvirus. Den første analysen er for SARS-CoV-2 (N), influensa A (H1N1 og H3N2) og influensa B. Den andre er for SARS-Cov-2 (N) og MERS (UpE og ORF1a). Disse analysene kan med hell implementeres i ethvert spesialisert laboratorium.

Abstract

Det alvorlige akutte luftveissyndromet coronavirus 2 (SARS-CoV-2) som forårsaker Coronavirus sykdom 2019 (COVID-19) er en alvorlig trussel mot allmennhetens helse. Under influensasesonger kan spredning av SARS-CoV-2 og andre respiratoriske virus forårsake en populasjonsomfattende byrde av luftveissykdom som er vanskelig å håndtere. For det må respiratoriske virus SARS-CoV-2, influensa A, influensa B og Midtøsten respiratorisk syndrom (MERS-CoV) overvåkes nøye i de kommende høst- og vintersesongene, spesielt når det gjelder SARS-CoV-2, influensa A og influensa B, som deler lignende epidemiologiske faktorer som følsomme populasjoner, overføringsmåte og kliniske syndromer. Uten målspesifikke analyser kan det være utfordrende å skille mellom tilfeller av disse virusene på grunn av deres likheter. Følgelig vil en sensitiv og målrettet multipleksanalyse som lett kan skille mellom disse virale målene, være nyttig for helsepersonell. I denne studien utviklet vi en sanntids revers transkriptase-PCR-basert analyse ved hjelp av et internt utviklet R3T ett-trinns RT-qPCR-sett for samtidig påvisning av SARS-CoV-2, influensa A, influensa B og SARS-CoV-2, MERS-CoV. Med så få som 10 kopier av deres syntetiske RNA kan vi med hell identifisere SARS-CoV-2, influensa A, influensa B og MERS-CoV-mål samtidig med 100% spesifisitet. Denne analysen er funnet å være nøyaktig, pålitelig, enkel, sensitiv og spesifikk. Den utviklede metoden kan brukes som en optimalisert SARS-CoV-2, influensa A, influensa B og SARS-CoV-2, MERS-CoV diagnostisk analyse på sykehus, medisinske sentre og diagnostiske laboratorier, samt til forskningsformål.

Introduction

Pandemien av den pågående koronavirussykdommen 2019 (COVID-19) er forårsaket av det nye koronaviruset kjent som alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2)1. På grunn av SAR-CoV-2s sterke smittsomhet og kapasitet for rask overføring, oppsto COVID-19-pandemien i Wuhan City, Kina, og spredte seg raskt over hele verden. Dette førte til slutt til starten av respiratoriske nødtegn og til og med død 2,3,4. COVID-19 har blitt erklært en pandemi i mer enn 213 land, og forventer en bratt økning i antall bekreftede tilfeller, som det fremgår av papirene publisert av forskjellige forskningsstudier 3,5. COVID-19 overføres primært av små luftveisdråper som infiserte individer slipper ut i miljøet og deretter blir utsatt for sårbare individer gjennom innånding eller nær kontakt med forurensede overflater. Når disse dråpene kommer i kontakt med slimhinnen i øynene, munnen eller nesen, kan en person bli smittet6. Statistikk utgitt av Verdens helseorganisasjon (WHO) viser at det har vært mer enn 76 millioner bekreftede tilfeller av pandemien over hele verden, med svimlende 7 millioner dødsfall7. Dermed klassifiserte FN pandemien forårsaket av COVID-19-sykdommen som en katastrofe på grunn av dens direkte innvirkning på livene til milliarder av mennesker over hele verden og hadde vidtrekkende økonomiske, miljømessige og sosiale effekter.

Folkehelseinitiativer, inkludert grundig testing, tidlig oppdagelse, kontaktsporing og isolering av tilfeller, har alle vist seg å være avgjørende for å holde denne pandemien under kontroll 8,9,10,11. Vintermånedene vil øke sirkulasjonen av andre luftveisvirus som influensa A og B med COVID-19-lignende symptomer, noe som gjør det vanskelig å identifisere, spore opp og isolere COVID-19-tilfeller tidlig. Hvert år starter influensa A- og B-utbruddet sent på høsten eller begynnelsen av januar med en forutsigbar sesongmessighet12. Tallrike epidemiologiske trekk deles av SARS-CoV-2 og influensavirus. Dessuten deler likheter i de mottakelige populasjonene som inkluderer barn, eldre, immunkompromitterte og personer med kroniske comorbiditeter som astma, kronisk obstruktiv lungesykdom, hjerte- og nyresvikt eller diabetes12,13. Disse virusene deler ikke bare sårbare befolkninger, men også overføringsruter for kontakt og luftveisdråper14. Det forventes at pasienter sannsynligvis kan få mer enn ett av disse respiratoriske virusene når influensasesongen nærmer seg14. For det må screeningen av SARS-CoV-2 og influensavirusene gjøres på symptomatiske pasienter før de isoleres. Å kjøre separate tester for de tre virusene (SARS-CoV-2, influensa A og influensa B) er ikke mulig på grunn av den globale mangelen på ressurser for nukleinsyreekstraksjon og diagnostikk. For å skjerme dem alle i en reaksjon, må en metode eller test utvikles.

Middle East respiratory syndrome (MERS)-CoV er et familiemedlem av humant koronavirus (CoV). De første MERS-CoV-virusisolatene kom fra en innlagt pasient i Saudi-Arabia som døde i september 2012 på grunn av akutte luftveisproblemer15. Det er bevis som tyder på at en fremtredende reservoarvert for MERS-CoV er dromedarkameler. Det er bevist at virus fra infiserte dromedarkameler er zoonotiske og dermed kan infisere mennesker16,17. Mennesker smittet med dette viruset kan spre det til andre gjennom nær kontakt18. Per 26. januar 2018 hadde det vært 2143 laboratoriebekreftede tilfeller av MERS-CoV-infeksjon, inkludert 750 dødsfall globalt19. De mest typiske MERS-CoV-symptomene er hoste, feber og kortpustethet. MERS-CoV-infeksjoner har også blitt rapportert å vise lungebetennelse, diaré og gastrointestinale sykdomssymptomer20. For tiden er ingen kommersiell vaksine eller spesifikk behandling for MERS-CoV tilgjengelig. Derfor er rask og presis diagnose avgjørende for å forhindre de utbredte MERS-CoV-utbruddene og skille MERS-CoV fra SARS-CoV-2-sykdom.

Til dags dato har mange tilnærminger blitt foreslått for å oppdage disse virusene som multiplex RT-PCR 21,22,23,24,25, CRISPR / Cas1226,27, CRISPR / Cas928 og CRISPR / Cas329, lateral flow immunoassay30, papirbaserte biomolekylære sensorer31, SHERLOCK-testing i en pott 32, DNA-aptamer33, loop-mediert isotermisk forsterkning (LAMP)19,34 osv. Hver av de nevnte metodene har unike fordeler og ulemper når det gjelder følsomhet og spesifisitet. Blant disse metodene er nukleinsyreforsterkningsbasert test: multiplex qRT-PCR, den vanligste og anses å være gullstandarden for diagnostisering av SARS-CoV-2, influensa A, influensa B og MERS-CoV.

I denne studien designet og vurderte vi ulike primerkombinasjoner og prober for effektiv, nøyaktig og samtidig påvisning av SARS-CoV-2, influensa A, influensa B og SARS-CoV-2, MERS-CoV ved bruk av standard vri syntetiske virale RNAer. De multipleksede analysene utviklet for enten MERS-CoV- eller SARS-CoV-2-målgener anbefales av Verdens helseorganisasjon (WHO). Disse genene koder generelt for proteiner og komplekser som bidrar til dannelsen av et replikasjons-/transkripsjonskompleks (RTC)35, slik som regionen innenfor den åpne leserammen 1a (ORF1a) som brukes til MERS-CoV-analyse. I tillegg er strukturelle proteiner kodet av gener som brukes i diagnostiske analyser som oppstrøms region av konvoluttgen (upE) og nukleokapsidgen (N) som brukes til MERS-CoV og SARS-Cov-2 analyser, henholdsvis35,36. Vi brukte internt R3T ett-trinns RT-qPCR-sett for å etablere RT-qPCR for påvisning av virus37. Virusdeteksjon, følsomhet, spesifisitet og dynamisk område for vårt R3T ett-trinns RT-qPCR-sett og primersett ble testet og evaluert ved hjelp av 10 ganger serielle fortynninger av standard vri syntetiske RNA-er. Den laveste praktiske deteksjonsgrensen var ca. 10 transkripsjonskopier per reaksjon. Som et resultat kan det interne R3T ett-trinns RT-qPCR-settet og primer-/sondesettene med hell brukes og implementeres for rutinemessig samtidig diagnose av SARS-CoV-2, influensa A, influensa B og SARS-CoV-2, MERS-CoV.

Protocol

1. Taq-polymeraseuttrykk og rensing Konstruer et plasmid med en spaltbar heksa-histidin-tag ved C-terminalen av enzymet. Transformer 50 ng av ekspresjonsvektoren til E. coli BL21-(DE3) stamme etter standardprotokollen38. Inokuler de transformerte cellene i fire 6 L kolber som hver inneholder 2 L 2YT mediebuljong ved 37 ° C med risting ved 170 o / min til OD 600 på 0,8 eller cellenummer 6,4 x 108 er nådd. Indusere Taq-p…

Representative Results

De siste årene har det vært betydelige fremskritt i den diagnostiske tilnærmingen for å oppdage vanlige luftveisvirus ved hjelp av PCR-tilnærminger 21,22,23,24,25. Til tross for disse fremskrittene har imidlertid den multipleksede tilnærmingen, som gjør det mulig å oppdage flere virus i en enkelt test, ikke blitt mye implementert, spesielt i RT-qPCR-pl…

Discussion

Det er en stor økonomisk byrde på helsevesenet over hele verden som følge av de høye infeksjons- og dødelighetsratene på grunn av spredningen av vanlige luftveisvirus som SARS-CoV-2, influensa A/B og MERS-CoV-variantene 12,19,20. Motivert av ansvarsfølelsen for å lette denne byrden, innså vi behovet for en rask, presis og tilgjengelig diagnostisk analyse som RT-qPCR for å skille mellom disse vanlige virusene i en test….

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av King Abdullah University of Science and Technology gjennom kjernefinansiering og National Term Grand Challenge (NTGC) til SMH

Materials

0.45 μm filter cups Thermo Scientific 291-4545
10X Tris-Glycine SDS running buffer Novex LC2675
6-well tissue culturing plates Corning 353046
Ammonium sulfate Fisher Scientific A701-3
Ampicillin Corning 61-238-RH
Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL Cytiva 17-1152-01
D-(+)-Biotin, 98+% Thermo Scientific A14207.60
DH10Bac competent cells Fisher Scientific 10361012
Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC) Thermo Scientific 68100
Dithiothreitol (DTT) Thermo Scientific R0862
Dnase/Rnase Free Distilled Water Ambion AM9930
dNTPs Thermo Scientific R0192
E. coli BL21(DE3) competent cells Invitrogen C600003
EDTA Fisher Scientific BP120-1
Elution Buffer Qiagen 19086
ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media) Expression Systems 96-001-01
FBS Solution Gibco A38400-01
Fugene (transfection reagent) Promega E2311
Gentamicin Fisher Scientific 15750060
Glycerol Sigma Aldrich G5516-500
IGEPAL CA-630 Sigma Aldrich I8896-100ml
Imidazole Sigma Aldrich 56750-1Kg
Influenza A (H1N1) synthetic RNA Twist Bioscience 103001
Influenza A (H3N2)  synthetic RNA Twist Bioscience 103002
Influenza B synthetic RNA Twist Bioscience 103003
IPTG Gold Biotechnology I3481C100
Kanamycin Gibco 11815-032
LB Agar Fisher Scientific BP1425-500
LB Broth media Fisher Scientific BP1426-500
Lysozyme Sigma Aldrich L6876-10G
Magnesium Chloride Sigma Aldrich 13152-1Kg
MERS-CoV synthetic RNA Twist Bioscience 103015
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL) Applied Biosystems 10310855
Mini- PROTEAN TGX Precast Gel Bio-Rad 456-1093
Miniprep kit Qiagen 27106
Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL Cytiva 17-3712-06
Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL Cytiva 17-5248-02
Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free Applied Biosystems 4311971
Potassium Chloride Fisher Bioreagents BP366-1
Primers and Probes Integrated DNA Technologies, Inc.
Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free Thermo Scientific A32955
Protein marker Fermentas 26616
RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex) Applied Biosystems
S.O.C medium Fisher Scientific 15544034
SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA Twist Bioscience 102024
Sf9 insect cells Gibco A35243
Sodium Chloride Sigma Aldrich S3014-1Kg
StrepTrap XT 5 mL Cytiva 29401323
Tetracycline IBI Scientific IB02200
Tris Base Molecular Biology Grade Promega H5135
Tris-HCl Affymetrix 22676
Tween 20 Sigma Aldrich P1379-100ml
X-Gal Invitrogen B1690
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nat Rev Microbiol. 19 (3), 141-154 (2021).
  2. Zhu, N., et al. A novel Coronavirus from patients with Pneumonia in China, 2019. N Engl J Med. 382 (8), 727-733 (2019).
  3. Huang, C., et al. Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. Lancet. 395 (10223), 497-506 (2020).
  4. Wu, F., et al. A new coronavirus associated with human respiratory disease in China. Nature. 579 (7798), 265-269 (2020).
  5. Yang, S., et al. Deep learning for detecting corona virus disease 2019 (COVID-19) on high-resolution computed tomography: a pilot study. Ann Transl Med. 8 (7), 450 (2020).
  6. El Hassan, M., et al. A review on the transmission of COVID-19 based on cough/sneeze/breath flows. Eur Phys J Plus. 137 (1), 1 (2022).
  7. . WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard Available from: https://covid19.who.int (2023)
  8. Kucharski, A. J., et al. Effectiveness of isolation, testing, contact tracing, and physical distancing on reducing transmission of SARS-CoV-2 in different settings: a mathematical modelling study. Lancet Infect Dis. 20 (10), 1151-1160 (2020).
  9. Reddy, K. P., et al. Cost-effectiveness of public health strategies for COVID-19 epidemic control in South Africa: a microsimulation modelling study. Lancet Glob Health. 9 (2), e120-e129 (2021).
  10. Cheng, H. Y., et al. Contact tracing assessment of COVID-19 transmission dynamics in Taiwan and risk at different exposure periods before and after symptom onset. JAMA Intern Med. 180 (9), 1156-1163 (2020).
  11. Kretzschmar, M. E., et al. Impact of delays on effectiveness of contact tracing strategies for COVID-19: a modelling study. Lancet Public Health. 5 (8), e452-e459 (2020).
  12. Krammer, F., et al. Influenza. Nat Rev Dis Primers. 4 (1), 3 (2018).
  13. Yang, J., et al. Prevalence of comorbidities and its effects in patients infected with SARS-CoV-2: a systematic review and meta-analysis. Int J Infect Dis. 94, 91-95 (2020).
  14. Lansbury, L., Lim, B., Baskaran, V., Lim, W. S. Co-infections in people with COVID-19: a systematic review and meta-analysis. J Infect. 81 (2), 266-275 (2020).
  15. Zaki, A. M., van Boheemen, S., Bestebroer, T. M., Osterhaus, A. D., Fouchier, R. A. Isolation of a novel coronavirus from a man with pneumonia in Saudi Arabia. N Engl J Med. 367 (19), 1814-1820 (2012).
  16. Azhar, E. I., et al. Evidence for camel-to-human transmission of MERS coronavirus. N Engl J Med. 370 (26), 2499-2505 (2014).
  17. Ling, Y., Qu, R., Luo, Y. Clinical analysis of the first patient with imported Middle East respiratory syndrome in China. Zhonghua Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue. 27 (8), 630-634 (2015).
  18. Nazer, R. I. Outbreak of Middle East Respiratory Syndrome-Coronavirus causes high fatality after cardiac operations. Ann Thorac Surg. 104 (2), e127-e129 (2017).
  19. Huang, P., et al. A rapid and specific assay for the detection of MERS-CoV. Front Microbiol. 9, 1101 (2018).
  20. Ezhilan, M., Suresh, I., Nesakumar, N. SARS-CoV, MERS-CoV and SARS-CoV-2: A diagnostic challenge. Measurement (Lond). 168, 108335 (2021).
  21. Ulloa, S., et al. A simple method for SARS-CoV-2 detection by rRT-PCR without the use of a commercial RNA extraction kit. J Virol Methods. 285, 113960 (2020).
  22. Kudo, E., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA by multiplex RT-qPCR. PLoS Biol. 18 (10), e3000867 (2020).
  23. Norz, D., Hoffmann, A., Aepfelbacher, M., Pfefferle, S., Lutgehetmann, M. Clinical evaluation of a fully automated, laboratory-developed multiplex RT-PCR assay integrating dual-target SARS-CoV-2 and influenza A/B detection on a high-throughput platform. J Med Microbiol. 70 (2), 001295 (2021).
  24. Yun, J., et al. Evaluation of three multiplex real-time reverse transcription PCR assays for simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and Respiratory Syncytial virus in nasopharyngeal swabs. J Korean Med Sci. 36 (48), e328 (2021).
  25. Lu, X., et al. Real-time reverse transcription-PCR assay panel for Middle East respiratory syndrome coronavirus. J Clin Microbiol. 52 (1), 67-75 (2014).
  26. Broughton, J. P., et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol. 38 (7), 870-874 (2020).
  27. Ali, Z., et al. iSCAN: An RT-LAMP-coupled CRISPR-Cas12 module for rapid, sensitive detection of SARS-CoV-2. Virus Res. 288, 198129 (2020).
  28. Ali, Z., et al. Bio-SCAN: A CRISPR/dCas9-based lateral flow assay for rapid, specific, and sensitive detection of SARS-CoV-2. ACS Synth Biol. 11 (1), 406-419 (2022).
  29. Yoshimi, K., et al. CRISPR-Cas3-based diagnostics for SARS-CoV-2 and Influenza virus. iScience. 25 (2), 103830 (2022).
  30. Chen, Z., et al. Rapid and sensitive detection of anti-SARS-CoV-2 IgG, using Lanthanide-doped nanoparticles-based lateral flow immunoassay. Anal Chem. 92 (10), 7226-7231 (2020).
  31. Kasetsirikul, S., et al. Detection of the SARS-CoV-2 humanized antibody with paper-based ELISA. Analyst. 145 (23), 7680-7686 (2020).
  32. Joung, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK One-Pot testing. N Engl J Med. 383 (15), 1492-1494 (2020).
  33. Chen, Z., Wu, Q., Chen, J., Ni, X., Dai, J. A DNA aptamer based method for detection of SARS-CoV-2 nucleocapsid protein. Virol Sin. 35 (3), 351-354 (2020).
  34. Jang, W. S., et al. Development of a multiplex Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) assay for on-site diagnosis of SARS CoV-2. PLoS One. 16 (3), e0248042 (2021).
  35. McBride, R., Fielding, B. C. The role of Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS)-Coronavirus accessory proteins in virus pathogenesis. Viruses-Basel. 4 (11), 2902-2923 (2012).
  36. AlBalwi, M. A., et al. Evolving sequence mutations in the Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV). J Infection Public Health. 13 (10), 1544-1550 (2020).
  37. Takahashi, M., et al. Quick and easy assembly of a One-Step qRT-PCR Kit for COVID-19 diagnostics using In-House enzymes. ACS Omega. 6 (11), 7374-7386 (2021).
  38. Sambrook, J., Fritsch, E. R., Maniatis, T. . Molecular cloning: A laboratory manual (2nd ed.). , (1989).
  39. Simpson, R. J. SDS-PAGE of Proteins. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
  40. Simpson, R. J. Staining proteins in gels with Coomassie blue. CSH Protoc. 2007, (2007).
  41. Takumi Yano, J. M. L., et al. Expression of the thermostable Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase by silkworm-baculovirus expression system. J Asia-Pac Entomol. 22 (2), 453-457 (2019).
  42. van Kasteren, P. B., et al. Comparison of seven commercial RT-PCR diagnostic kits for COVID-19. J Clin Virol. 128, 104412 (2020).
  43. Shu, B., et al. Multiplex Real-Time reverse transcription PCR for Influenza A virus, Influenza B virus, and Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2. Emerg Infect Dis. 27 (7), 1821-1830 (2021).
  44. Engelke, D. R., Krikos, A., Bruck, M. E., Ginsburg, D. Purification of Thermus aquaticus DNA polymerase expressed in Escherichia coli. Anal Biochem. 191 (2), 396-400 (1990).
  45. Pabbaraju, K., Wong, A. A., Ma, R., Zelyas, N., Tipples, G. A. Development and validation of a multiplex reverse transcriptase-PCR assay for simultaneous testing of Influenza A, Influenza B and SARS-CoV-2. J Virol Methods. 293, 114151 (2020).
  46. Hirotsu, Y., et al. Analysis of COVID-19 and non-COVID-19 viruses, including Influenza viruses, to determine the influence of intensive preventive measures in Japan. J Clin Virol. 132, 104634 (2020).
  47. Sellner, L. N., Coelen, R. J., Mackenzie, J. S. Reverse-Transcriptase inhibits Taq Polymerase-Activity. Nucleic Acids Res. 20 (7), 1487-1490 (1992).

Tags

SARS-CoV-2Influenza AInfluenza BMERS-CoVMultiplex Real-time RT-qPCRRespiratory VirusesIn-house Developed R3T One-step RT-qPCR KitDiagnostic AssaySimultaneous DetectionSensitivitySpecificity
check_url/it/65822?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Althobaiti, A., Hamdan, K., Sobhy, M. A., Rawas, R., Takahashi, M., Artyukh, O., Tehseen, M. Development of Multiplex Real-Time RT-qPCR Assays for the Detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and MERS-CoV. J. Vis. Exp. (201), e65822, doi:10.3791/65822 (2023).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image