Sviluppo di saggi RT-qPCR real-time multiplex per la rilevazione di SARS-CoV-2, influenza A/B e MERS-CoV
Summary
Presentiamo due kit RT-qPCR one-step basati su sonde per i virus respiratori comuni. Il primo test è per SARS-CoV-2 (N), influenza A (H1N1 e H3N2) e influenza B. Il secondo è per SARS-Cov-2 (N) e MERS (UpE e ORF1a). Questi saggi possono essere implementati con successo in qualsiasi laboratorio specializzato.
Abstract
La sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) che causa la malattia da Coronavirus 2019 (COVID-19) è una seria minaccia per la salute pubblica. Durante le stagioni influenzali, la diffusione del SARS-CoV-2 e di altri virus respiratori può causare un carico di malattie respiratorie a livello di popolazione che è difficile da gestire. Per questo, i virus respiratori SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e sindrome respiratoria del Medio Oriente (MERS-CoV) dovranno essere attentamente monitorati nelle prossime stagioni autunnali e invernali, in particolare nel caso di SARS-CoV-2, Influenza A e Influenza B, che condividono fattori epidemiologici simili come popolazioni suscettibili, modalità di trasmissione e sindromi cliniche. Senza saggi specifici per il bersaglio, può essere difficile distinguere tra i casi di questi virus a causa delle loro somiglianze. Di conseguenza, un test multiplex sensibile e mirato, in grado di differenziare facilmente tra questi bersagli virali, sarà utile per gli operatori sanitari. In questo studio, abbiamo sviluppato un test basato sulla PCR con trascrittasi inversa in tempo reale utilizzando un kit RT-qPCR R3T one-step sviluppato internamente per il rilevamento simultaneo di SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e SARS-CoV-2, MERS-CoV. Con un minimo di 10 copie dei loro RNA sintetici, possiamo identificare con successo i bersagli di SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e MERS-CoV contemporaneamente con una specificità del 100%. Questo test è risultato accurato, affidabile, semplice, sensibile e specifico. Il metodo sviluppato può essere utilizzato come test diagnostico ottimizzato per SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e SARS-CoV-2, MERS-CoV in ospedali, centri medici e laboratori diagnostici, nonché per scopi di ricerca.
Introduction
La pandemia della malattia da coronavirus 2019 (COVID-19) in corso è causata dal nuovo coronavirus noto come sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2)1. A causa della forte contagiosità e della capacità di trasmissione rapida del SAR-CoV-2, la pandemia di COVID-19 è emersa nella città di Wuhan, in Cina, e si è diffusa rapidamente in tutto il mondo. Questo alla fine ha portato all’inizio di segni di distress respiratorio e persino alla morte 2,3,4. Il COVID-19 è stato dichiarato pandemia in più di 213 paesi, prevedendo un forte aumento del numero di casi confermati, come evidenziato dai documenti pubblicati da diversi studi di ricerca 3,5. Il COVID-19 si trasmette principalmente attraverso piccole goccioline respiratorie che le persone infette rilasciano nell’ambiente e quindi vengono esposte a persone vulnerabili attraverso l’inalazione o il contatto ravvicinato con superfici contaminate. Quando queste goccioline entrano in contatto con la mucosa degli occhi, della bocca o del naso, una persona può essere infettata6. Le statistiche pubblicate dall’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) mostrano che ci sono stati più di 76 milioni di casi confermati di pandemia in tutto il mondo, con l’incredibile cifra di 7 milionidi morti. Pertanto, le Nazioni Unite hanno classificato la pandemia causata dalla malattia COVID-19 come un disastro a causa del suo impatto diretto sulla vita di miliardi di persone in tutto il mondo e ha avuto effetti economici, ambientali e sociali di vasta portata.
Le iniziative di salute pubblica, tra cui test approfonditi, diagnosi precoce, tracciamento dei contatti e isolamento dei casi, si sono dimostrate cruciali per tenere sotto controllo questa pandemia 8,9,10,11. I mesi invernali aumenteranno la circolazione di altri virus respiratori come l’influenza A e B con sintomi simili al COVID-19 che rendono difficile identificare, rintracciare e isolare precocemente i casi di COVID-19. Ogni anno, l’epidemia di influenza A e B inizia nel tardo autunno o all’inizio di gennaio con una stagionalità prevedibile12. Numerosi tratti epidemiologici sono condivisi dai virus SARS-CoV-2 e influenzali. Inoltre, condividendo somiglianze nelle popolazioni suscettibili che includono bambini, anziani, immunocompromessi e individui con comorbidità croniche come asma, broncopneumopatia cronica ostruttiva, insufficienza cardiaca e renale o diabete12,13. Questi virus non solo condividono popolazioni vulnerabili, ma anche vie di trasmissione di contatto e goccioline respiratorie14. Si prevede che i pazienti possano probabilmente contrarre più di uno di questi virus respiratori conl’avvicinarsi della stagione influenzale. Per questo, lo screening del SARS-CoV-2 e dei virus dell’influenza deve essere eseguito su pazienti sintomatici prima che vengano isolati. L’esecuzione di test separati per i tre virus (SARS-CoV-2, Influenza A e Influenza B) non è possibile a causa della mancanza globale di risorse per l’estrazione e la diagnostica degli acidi nucleici. Per esaminarli tutti in un’unica reazione, è necessario sviluppare un metodo o un test.
La sindrome respiratoria del Medio Oriente (MERS)-CoV è un membro della famiglia del coronavirus umano (CoV). I primi isolati del virus MERS-CoV provenivano da un paziente ricoverato in Arabia Saudita che era morto nel settembre 2012 a causa di problemi respiratori acuti15. Ci sono prove che suggeriscono che un importante ospite serbatoio per MERS-CoV sono i dromedari. È stato dimostrato che i virus dei dromedari infetti sono zoonotici e quindi possono infettare l’uomo16,17. Gli esseri umani infettati da questo virus possono diffonderlo ad altri attraverso il contatto ravvicinato18. Al 26 gennaio 2018, ci sono stati 2143 casi confermati in laboratorio di infezione da MERS-CoV, inclusi 750 decessi a livello globale19. I sintomi più tipici della MERS-CoV sono tosse, febbre e mancanza di respiro. È stato anche segnalato che le infezioni da MERS-CoV mostrano sintomi di polmonite, diarrea e malattie gastrointestinali20. Attualmente, non è disponibile alcun vaccino commerciale o trattamento specifico per MERS-CoV. Pertanto, una diagnosi tempestiva e precisa è essenziale per prevenire le diffuse epidemie di MERS-CoV e differenziare la malattia MERS-CoV dalla malattia SARS-CoV-2.
Ad oggi, sono stati proposti molti approcci per rilevare questi virus, come RT-PCR multiplex 21,22,23,24,25, CRISPR/Cas1226,27, CRISPR/Cas928 e CRISPR/Cas329, test immunologico a flusso laterale30, sensori biomolecolari cartacei31, test SHERLOCK in one pot32, aptamero del DNA33, isoterma mediata da loop amplificazione (LAMP)19,34, ecc. Ognuno dei metodi sopra menzionati presenta vantaggi e svantaggi unici in termini di sensibilità e specificità. Tra questi metodi, il test basato sull’amplificazione degli acidi nucleici: qRT-PCR multiplex, è il più comune ed è considerato il gold standard per la diagnosi di SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e MERS-CoV.
In questo studio, abbiamo progettato e valutato varie combinazioni di primer e sonde per il rilevamento efficace, accurato e simultaneo di SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e SARS-CoV-2, MERS-CoV utilizzando RNA virali sintetici a torsione standard. I test multiplexati sviluppati per i geni bersaglio di MERS-CoV o SARS-CoV-2 sono raccomandati dall’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS). Questi geni generalmente codificano proteine e complessi che contribuiscono alla formazione di un complesso di replicazione/trascrizione (RTC)35 come la regione all’interno del frame di lettura aperto 1a (ORF1a) utilizzato per il test MERS-CoV. Inoltre, le proteine strutturali sono codificate dai geni utilizzati nei saggi diagnostici come il gene della regione a monte dell’involucro (upE) e il gene del nucleocapside (N) che vengono utilizzati rispettivamente per i saggi MERS-CoV e SARS-Cov-235,36. Abbiamo utilizzato il kit RT-qPCR R3T one-step interno per stabilire la RT-qPCR per il rilevamento dei virus37. Il rilevamento dei virus, la sensibilità, la specificità e la gamma dinamica del nostro kit RT-qPCR R3T one-step e dei set di primer sono stati testati e valutati utilizzando diluizioni seriali di 10 volte degli RNA sintetici twist standard. Il limite di rilevamento pratico più basso era di circa 10 copie di trascrizioni per reazione. Di conseguenza, il kit RT-qPCR one-step R3T e i set di primer/sonde possono essere utilizzati e implementati con successo per la diagnosi simultanea di routine di SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e SARS-CoV-2, MERS-CoV.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il sistema sanitario di tutto il mondo è gravoso dal pesante onere economico derivante dagli elevati tassi di infezione e mortalità dovuti alla diffusione di virus respiratori comuni come le varianti SARS-CoV-2, Influenza A/B e MERS-CoV 12,19,20. Motivati dal senso di responsabilità verso l’alleggerimento di questo onere, ci siamo resi conto della necessità di un test diagnostico rapido, preciso e accessibile come la RT-qPCR…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla King Abdullah University of Science and Technology attraverso il finanziamento di base e il National Term Grand Challenge (NTGC) a SMH.
Materials
| 0.45 μm filter cups | Thermo Scientific | 291-4545 | |
| 10X Tris-Glycine SDS running buffer | Novex | LC2675 | |
| 6-well tissue culturing plates | Corning | 353046 | |
| Ammonium sulfate | Fisher Scientific | A701-3 | |
| Ampicillin | Corning | 61-238-RH | |
| Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL | Cytiva | 17-1152-01 | |
| D-(+)-Biotin, 98+% | Thermo Scientific | A14207.60 | |
| DH10Bac competent cells | Fisher Scientific | 10361012 | |
| Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC) | Thermo Scientific | 68100 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | R0862 | |
| Dnase/Rnase Free Distilled Water | Ambion | AM9930 | |
| dNTPs | Thermo Scientific | R0192 | |
| E. coli BL21(DE3) competent cells | Invitrogen | C600003 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | |
| Elution Buffer | Qiagen | 19086 | |
| ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media) | Expression Systems | 96-001-01 | |
| FBS Solution | Gibco | A38400-01 | |
| Fugene (transfection reagent) | Promega | E2311 | |
| Gentamicin | Fisher Scientific | 15750060 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516-500 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | I8896-100ml | |
| Imidazole | Sigma Aldrich | 56750-1Kg | |
| Influenza A (H1N1) synthetic RNA | Twist Bioscience | 103001 | |
| Influenza A (H3N2) synthetic RNA | Twist Bioscience | 103002 | |
| Influenza B synthetic RNA | Twist Bioscience | 103003 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | I3481C100 | |
| Kanamycin | Gibco | 11815-032 | |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| LB Broth media | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Lysozyme | Sigma Aldrich | L6876-10G | |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | 13152-1Kg | |
| MERS-CoV synthetic RNA | Twist Bioscience | 103015 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL) | Applied Biosystems | 10310855 | |
| Mini- PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 456-1093 | |
| Miniprep kit | Qiagen | 27106 | |
| Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL | Cytiva | 17-3712-06 | |
| Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL | Cytiva | 17-5248-02 | |
| Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free | Applied Biosystems | 4311971 | |
| Potassium Chloride | Fisher Bioreagents | BP366-1 | |
| Primers and Probes | Integrated DNA Technologies, Inc. | ||
| Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free | Thermo Scientific | A32955 | |
| Protein marker | Fermentas | 26616 | |
| RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex) | Applied Biosystems | ||
| S.O.C medium | Fisher Scientific | 15544034 | |
| SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA | Twist Bioscience | 102024 | |
| Sf9 insect cells | Gibco | A35243 | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S3014-1Kg | |
| StrepTrap XT 5 mL | Cytiva | 29401323 | |
| Tetracycline | IBI Scientific | IB02200 | |
| Tris Base Molecular Biology Grade | Promega | H5135 | |
| Tris-HCl | Affymetrix | 22676 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379-100ml | |
| X-Gal | Invitrogen | B1690 |
Riferimenti
- Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nat Rev Microbiol. 19 (3), 141-154 (2021).
- Zhu, N., et al. A novel Coronavirus from patients with Pneumonia in China, 2019. N Engl J Med. 382 (8), 727-733 (2019).
- Huang, C., et al. Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. Lancet. 395 (10223), 497-506 (2020).
- Wu, F., et al. A new coronavirus associated with human respiratory disease in China. Nature. 579 (7798), 265-269 (2020).
- Yang, S., et al. Deep learning for detecting corona virus disease 2019 (COVID-19) on high-resolution computed tomography: a pilot study. Ann Transl Med. 8 (7), 450 (2020).
- El Hassan, M., et al. A review on the transmission of COVID-19 based on cough/sneeze/breath flows. Eur Phys J Plus. 137 (1), 1 (2022).
- . WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard Available from: https://covid19.who.int (2023)
- Kucharski, A. J., et al. Effectiveness of isolation, testing, contact tracing, and physical distancing on reducing transmission of SARS-CoV-2 in different settings: a mathematical modelling study. Lancet Infect Dis. 20 (10), 1151-1160 (2020).
- Reddy, K. P., et al. Cost-effectiveness of public health strategies for COVID-19 epidemic control in South Africa: a microsimulation modelling study. Lancet Glob Health. 9 (2), e120-e129 (2021).
- Cheng, H. Y., et al. Contact tracing assessment of COVID-19 transmission dynamics in Taiwan and risk at different exposure periods before and after symptom onset. JAMA Intern Med. 180 (9), 1156-1163 (2020).
- Kretzschmar, M. E., et al. Impact of delays on effectiveness of contact tracing strategies for COVID-19: a modelling study. Lancet Public Health. 5 (8), e452-e459 (2020).
- Krammer, F., et al. Influenza. Nat Rev Dis Primers. 4 (1), 3 (2018).
- Yang, J., et al. Prevalence of comorbidities and its effects in patients infected with SARS-CoV-2: a systematic review and meta-analysis. Int J Infect Dis. 94, 91-95 (2020).
- Lansbury, L., Lim, B., Baskaran, V., Lim, W. S. Co-infections in people with COVID-19: a systematic review and meta-analysis. J Infect. 81 (2), 266-275 (2020).
- Zaki, A. M., van Boheemen, S., Bestebroer, T. M., Osterhaus, A. D., Fouchier, R. A. Isolation of a novel coronavirus from a man with pneumonia in Saudi Arabia. N Engl J Med. 367 (19), 1814-1820 (2012).
- Azhar, E. I., et al. Evidence for camel-to-human transmission of MERS coronavirus. N Engl J Med. 370 (26), 2499-2505 (2014).
- Ling, Y., Qu, R., Luo, Y. Clinical analysis of the first patient with imported Middle East respiratory syndrome in China. Zhonghua Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue. 27 (8), 630-634 (2015).
- Nazer, R. I. Outbreak of Middle East Respiratory Syndrome-Coronavirus causes high fatality after cardiac operations. Ann Thorac Surg. 104 (2), e127-e129 (2017).
- Huang, P., et al. A rapid and specific assay for the detection of MERS-CoV. Front Microbiol. 9, 1101 (2018).
- Ezhilan, M., Suresh, I., Nesakumar, N. SARS-CoV, MERS-CoV and SARS-CoV-2: A diagnostic challenge. Measurement (Lond). 168, 108335 (2021).
- Ulloa, S., et al. A simple method for SARS-CoV-2 detection by rRT-PCR without the use of a commercial RNA extraction kit. J Virol Methods. 285, 113960 (2020).
- Kudo, E., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA by multiplex RT-qPCR. PLoS Biol. 18 (10), e3000867 (2020).
- Norz, D., Hoffmann, A., Aepfelbacher, M., Pfefferle, S., Lutgehetmann, M. Clinical evaluation of a fully automated, laboratory-developed multiplex RT-PCR assay integrating dual-target SARS-CoV-2 and influenza A/B detection on a high-throughput platform. J Med Microbiol. 70 (2), 001295 (2021).
- Yun, J., et al. Evaluation of three multiplex real-time reverse transcription PCR assays for simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and Respiratory Syncytial virus in nasopharyngeal swabs. J Korean Med Sci. 36 (48), e328 (2021).
- Lu, X., et al. Real-time reverse transcription-PCR assay panel for Middle East respiratory syndrome coronavirus. J Clin Microbiol. 52 (1), 67-75 (2014).
- Broughton, J. P., et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol. 38 (7), 870-874 (2020).
- Ali, Z., et al. iSCAN: An RT-LAMP-coupled CRISPR-Cas12 module for rapid, sensitive detection of SARS-CoV-2. Virus Res. 288, 198129 (2020).
- Ali, Z., et al. Bio-SCAN: A CRISPR/dCas9-based lateral flow assay for rapid, specific, and sensitive detection of SARS-CoV-2. ACS Synth Biol. 11 (1), 406-419 (2022).
- Yoshimi, K., et al. CRISPR-Cas3-based diagnostics for SARS-CoV-2 and Influenza virus. iScience. 25 (2), 103830 (2022).
- Chen, Z., et al. Rapid and sensitive detection of anti-SARS-CoV-2 IgG, using Lanthanide-doped nanoparticles-based lateral flow immunoassay. Anal Chem. 92 (10), 7226-7231 (2020).
- Kasetsirikul, S., et al. Detection of the SARS-CoV-2 humanized antibody with paper-based ELISA. Analyst. 145 (23), 7680-7686 (2020).
- Joung, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK One-Pot testing. N Engl J Med. 383 (15), 1492-1494 (2020).
- Chen, Z., Wu, Q., Chen, J., Ni, X., Dai, J. A DNA aptamer based method for detection of SARS-CoV-2 nucleocapsid protein. Virol Sin. 35 (3), 351-354 (2020).
- Jang, W. S., et al. Development of a multiplex Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) assay for on-site diagnosis of SARS CoV-2. PLoS One. 16 (3), e0248042 (2021).
- McBride, R., Fielding, B. C. The role of Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS)-Coronavirus accessory proteins in virus pathogenesis. Viruses-Basel. 4 (11), 2902-2923 (2012).
- AlBalwi, M. A., et al. Evolving sequence mutations in the Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV). J Infection Public Health. 13 (10), 1544-1550 (2020).
- Takahashi, M., et al. Quick and easy assembly of a One-Step qRT-PCR Kit for COVID-19 diagnostics using In-House enzymes. ACS Omega. 6 (11), 7374-7386 (2021).
- Sambrook, J., Fritsch, E. R., Maniatis, T. . Molecular cloning: A laboratory manual (2nd ed.). , (1989).
- Simpson, R. J. SDS-PAGE of Proteins. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
- Simpson, R. J. Staining proteins in gels with Coomassie blue. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Takumi Yano, J. M. L., et al. Expression of the thermostable Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase by silkworm-baculovirus expression system. J Asia-Pac Entomol. 22 (2), 453-457 (2019).
- van Kasteren, P. B., et al. Comparison of seven commercial RT-PCR diagnostic kits for COVID-19. J Clin Virol. 128, 104412 (2020).
- Shu, B., et al. Multiplex Real-Time reverse transcription PCR for Influenza A virus, Influenza B virus, and Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2. Emerg Infect Dis. 27 (7), 1821-1830 (2021).
- Engelke, D. R., Krikos, A., Bruck, M. E., Ginsburg, D. Purification of Thermus aquaticus DNA polymerase expressed in Escherichia coli. Anal Biochem. 191 (2), 396-400 (1990).
- Pabbaraju, K., Wong, A. A., Ma, R., Zelyas, N., Tipples, G. A. Development and validation of a multiplex reverse transcriptase-PCR assay for simultaneous testing of Influenza A, Influenza B and SARS-CoV-2. J Virol Methods. 293, 114151 (2020).
- Hirotsu, Y., et al. Analysis of COVID-19 and non-COVID-19 viruses, including Influenza viruses, to determine the influence of intensive preventive measures in Japan. J Clin Virol. 132, 104634 (2020).
- Sellner, L. N., Coelen, R. J., Mackenzie, J. S. Reverse-Transcriptase inhibits Taq Polymerase-Activity. Nucleic Acids Res. 20 (7), 1487-1490 (1992).
