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Biologia

SARS-CoV-2, 인플루엔자 A/B 및 MERS-CoV 검출을 위한 다중 Real-Time RT-qPCR 분석 개발

Published: November 10, 2023
doi:
10.3791/65822
, , , , , ,
1Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE),King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

Summary

일반적인 호흡기 바이러스에 대한 두 가지 프로브 기반 원스텝 RT-qPCR 키트를 소개합니다. 첫 번째 분석은 SARS-CoV-2(N), 인플루엔자 A(H1N1 및 H3N2) 및 인플루엔자 B에 대한 것입니다. 두 번째는 SARS-Cov-2(N)와 메르스(UPE 및 ORF1a)에 대한 것입니다. 이러한 분석은 모든 전문 실험실에서 성공적으로 구현할 수 있습니다.

Abstract

코로나바이러스 질병 2019(COVID-19)를 유발하는 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)는 일반 대중의 건강에 심각한 위협이 됩니다. 인플루엔자 시즌에는 SARS-CoV-2 및 기타 호흡기 바이러스의 확산으로 인해 관리하기 어려운 호흡기 질환에 대한 인구 전체의 부담이 발생할 수 있습니다. 이를 위해 다가오는 가을과 겨울철에 호흡기 바이러스인 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 중동호흡기증후군(MERS-CoV)을 주의 깊게 관찰해야 하며, 특히 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B의 경우 감염 취약 인구, 전염 방식 및 임상 증후군과 같은 유사한 역학적 요인을 공유합니다. 표적 특이적 분석이 없으면 이러한 바이러스의 유사성으로 인해 사례를 구별하는 것이 어려울 수 있습니다. 따라서 이러한 바이러스 표적을 쉽게 구별할 수 있는 민감한 표적 다중 분석은 의료 종사자에게 유용할 것입니다. 본 연구에서는 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, SARS-CoV-2, MERS-CoV의 동시 검출을 위해 자체 개발한 R3T 원스텝 RT-qPCR 키트를 활용하여 실시간 역전사효소-PCR 기반 분석을 개발했습니다. 10개의 합성 RNA 사본만으로도 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B 및 MERS-CoV 표적을 100% 특이성으로 동시에 성공적으로 식별할 수 있습니다. 이 분석은 정확하고, 신뢰할 수 있으며, 간단하고, 민감하고, 특이적인 것으로 밝혀졌습니다. 개발된 방법은 병원, 의료센터, 진단 실험실에서 최적화된 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, SARS-CoV-2, MERS-CoV 진단 분석법으로 사용할 수 있을 뿐만 아니라 연구 목적으로도 사용할 수 있습니다.

Introduction

현재 진행 중인 코로나바이러스 질병 2019(COVID-19)의 팬데믹은 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)1로 알려진 신종 코로나바이러스에 의해 발생합니다. SAR-CoV-2의 강력한 전염성과 빠른 전파 능력으로 인해 COVID-19 전염병은 중국 우한시에서 발생하여 전 세계로 빠르게 확산되었습니다. 이것은 결국 호흡 곤란 징후의 시작과 심지어 죽음으로 이어졌다 2,3,4. COVID-19는 213개국 이상에서 팬데믹으로 선언되었으며, 다양한 연구 조사에서 발표된 논문에서 알 수 있듯이 확진 사례의 수가 급격히 증가할 것으로 예상됩니다 3,5. COVID-19는 주로 감염된 개인이 환경으로 방출한 다음 흡입 또는 오염된 표면과의 밀접한 접촉을 통해 취약한 개인에게 노출되는 작은 호흡기 비말에 의해 전염됩니다. 이러한 비말이 눈, 입 또는 코의 점막에 닿으면 감염될 수 있다6. 세계보건기구(WHO)가 발표한 통계에 따르면 전 세계적으로 7,600만 건 이상의 팬데믹 확진 사례가 발생했으며 사망자는 700만 명에 달합니다7. 따라서 UN은 COVID-19 질병으로 인한 전염병이 전 세계 수십억 명의 삶에 직접적인 영향을 미치고 광범위한 경제적, 환경적, 사회적 영향을 미쳤기 때문에 재난으로 분류했습니다.

철저한 검사, 조기 발견, 접촉자 추적 및 사례 격리를 포함한 공중 보건 이니셔티브는 모두 이 전염병을 통제하는 데 중요한 것으로 나타났습니다 8,9,10,11. 겨울철에는 COVID-19와 유사한 증상을 보이는 인플루엔자 A 및 B와 같은 다른 호흡기 바이러스의 순환이 증가하여 COVID-19 사례를 조기에 식별, 추적 및 격리하기가 어렵습니다. 매년 A형 인플루엔자와 B형 인플루엔자는 늦가을이나 1월 초에 발생하며, 계절성을 예측할 수 있다12. SARS-CoV-2 및 인플루엔자 바이러스는 수많은 역학적 특성을 공유합니다. 또한 어린이, 노인, 면역 저하자, 천식, 만성 폐쇄성 폐질환, 심부전 및 신부전, 당뇨병과 같은 만성 동반 질환이 있는 개인을 포함하는 감수성 인구에서 유사성을 공유합니다12,13. 이러한 바이러스는 취약한 인구 집단을 공유할 뿐만 아니라 접촉 및 호흡기 비말의 전염 경로도 공유한다14. 독감 시즌이 다가옴에 따라 환자는 이러한 호흡기 바이러스 중 하나 이상에 감염될 가능성이 있을 것으로 예상됩니다14. 이를 위해서는 증상이 있는 환자를 격리하기 전에 SARS-CoV-2 및 인플루엔자 바이러스를 선별해야 합니다. 세 가지 바이러스(SARS-CoV-2, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B)에 대해 별도의 테스트를 실행하는 것은 핵산 추출 및 진단을 위한 전 세계적인 리소스 부족으로 인해 불가능합니다. 한 번의 반응으로 모두 스크리닝하려면 방법 또는 테스트를 개발해야 합니다.

중동호흡기증후군(MERS)-CoV는 인간 코로나바이러스(CoV) 계열입니다. 최초의 MERS-CoV 바이러스 분리는 2012년 9월 급성 호흡기 질환으로 사망한 사우디아라비아의 입원 환자로부터 나왔다15. MERS-CoV의 두드러진 저수지 숙주가 단봉낙타임을 시사하는 증거가 있습니다. 감염된 단봉낙타의 바이러스는 인수공통감염병이므로 인간을 감염시킬 수 있음이 입증되었다16,17. 이 바이러스에 감염된 사람은 밀접 접촉을 통해 다른 사람에게 전염시킬 수 있다18. 2018년 1월 26일 현재, 전 세계적으로 750명의 사망자를 포함하여 2143명의 MERS-CoV 감염 사례가 확인되었습니다. 가장 전형적인 MERS-CoV 증상은 기침, 발열, 숨가쁨입니다. MERS-CoV 감염은 폐렴, 설사 및 위장 질환 증상을 나타내는 것으로 보고되었다20. 현재 MERS-CoV에 대한 상용 백신이나 특정 치료법은 없습니다. 따라서 MERS-CoV의 확산을 예방하고 SARS-CoV-2 질병과 MERS-CoV를 감별하기 위해서는 신속하고 정확한 진단이 필수적입니다.

현재까지 이러한 바이러스를 검출하기 위해 멀티플렉스 RT-PCR 21,22,23,24,25, CRISPR/Cas1226,27, CRISPR/Cas928 및 CRISPR/Cas329, 측면 유동 면역분석법(30), 종이 기반 생체 분자 센서(31), SHERLOCK 테스트 in one pot32, DNA aptamer 33, loop-mediated isothermal 증폭 (LAMP)19,34 등 앞서 언급한 각 방법은 민감도와 특이성 측면에서 고유한 장점과 단점이 있습니다. 이러한 방법 중 핵산 증폭 기반 검사인 멀티플렉스 qRT-PCR이 가장 일반적이며 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B 및 MERS-CoV 진단을 위한 황금 표준으로 간주됩니다.

이 연구에서는 표준 트위스트 합성 바이러스 RNA를 활용하여 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B 및 SARS-CoV-2, MERS-CoV의 효과적이고 정확하며 동시 검출을 위한 다양한 프라이머 조합 및 프로브를 설계하고 평가했습니다. MERS-CoV 또는 SARS-CoV-2 표적 유전자에 대해 개발된 다중 분석은 세계보건기구(WHO)에서 권장합니다. 이러한 유전자는 일반적으로 MERS-CoV 분석에 사용되는 개방 판독 프레임 1a(ORF1a) 내 영역과 같은 복제/전사 복합체(RTC)35 형성에 기여하는 단백질 및 복합체를 암호화합니다. 또한, 구조 단백질은 MERS-CoV 및 SARS-Cov-2 분석에 사용되는 외피 유전자(upE) 및 뉴클레오캡시드 유전자(N)의 업스트림 영역(upstream)과 같은 진단 분석에 사용되는 유전자에 의해 암호화됩니다(각각 35,36). 바이러스 검출을 위한 RT-qPCR을 구축하기 위해 자체 R3T 원스텝 RT-qPCR 키트를 사용했다37. R3T 원스텝 RT-qPCR 키트 및 프라이머 세트의 바이러스 검출, 민감도, 특이성 및 동적 범위는 표준 트위스트 합성 RNA의 10배 연속 희석을 사용하여 테스트 및 평가되었습니다. 가장 낮은 실제 검출 한계는 반응당 약 10개의 전사체 사본이었습니다. 그 결과, SARS-CoV-2, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B 및 SARS-CoV-2, MERS-CoV의 일상적인 동시 진단에 자체 R3T 원스텝 RT-qPCR 키트 및 프라이머/프로브 세트를 성공적으로 사용하고 구현할 수 있습니다.

Protocol

1. Taq 중합효소 발현 및 정제 효소의 C-말단에 절단 가능한 hexa-histidine tag를 가진 플라스미드를 구축합니다. 발현 벡터의 50ng를 표준 프로토콜38에 따라 E. coli BL21-(DE3) 균주로 형질전환시킵니다. 형질전환된 세포를 각각 2L의 2YT 배지 육수를 포함하는 4개의 6L 플라스크에 37°C에서 170rpm으로 진수하여 0.8의 OD 600 또는 세포 번호 6.4 x 108</sup…

Representative Results

최근 몇 년 동안 PCR 접근법 21,22,23,24,25를 사용하여 일반적인 호흡기 바이러스를 검출하기 위한 진단 접근법이 크게 발전했습니다. 그러나 이러한 발전에도 불구하고 단일 테스트에서 여러 바이러스를 검출할 수 있는 다중화 접근 방식은 특히 RT-qPCR 플랫폼에서 널리 구현되?…

Discussion

SARS-CoV-2, 인플루엔자 A/B 및 MERS-CoV 변종과 같은 일반적인 호흡기 바이러스의 확산으로 인한 높은 감염률 및 사망률로 인해 전 세계 의료 시스템에 막대한 경제적 부담이 있습니다 12,19,20. 이러한 부담을 덜어주겠다는 책임감으로 우리는 RT-qPCR과 같은 빠르고 정확하며 접근 가능한 진단 분석법이 필요하다는 것을 깨달았습니다.?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작업은 King Abdullah University of Science and Technology의 핵심 자금 지원과 NTGC(National Term Grand Challenge)를 통해 SMH에 지원되었습니다.

Materials

0.45 μm filter cups Thermo Scientific 291-4545
10X Tris-Glycine SDS running buffer Novex LC2675
6-well tissue culturing plates Corning 353046
Ammonium sulfate Fisher Scientific A701-3
Ampicillin Corning 61-238-RH
Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL Cytiva 17-1152-01
D-(+)-Biotin, 98+% Thermo Scientific A14207.60
DH10Bac competent cells Fisher Scientific 10361012
Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC) Thermo Scientific 68100
Dithiothreitol (DTT) Thermo Scientific R0862
Dnase/Rnase Free Distilled Water Ambion AM9930
dNTPs Thermo Scientific R0192
E. coli BL21(DE3) competent cells Invitrogen C600003
EDTA Fisher Scientific BP120-1
Elution Buffer Qiagen 19086
ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media) Expression Systems 96-001-01
FBS Solution Gibco A38400-01
Fugene (transfection reagent) Promega E2311
Gentamicin Fisher Scientific 15750060
Glycerol Sigma Aldrich G5516-500
IGEPAL CA-630 Sigma Aldrich I8896-100ml
Imidazole Sigma Aldrich 56750-1Kg
Influenza A (H1N1) synthetic RNA Twist Bioscience 103001
Influenza A (H3N2)  synthetic RNA Twist Bioscience 103002
Influenza B synthetic RNA Twist Bioscience 103003
IPTG Gold Biotechnology I3481C100
Kanamycin Gibco 11815-032
LB Agar Fisher Scientific BP1425-500
LB Broth media Fisher Scientific BP1426-500
Lysozyme Sigma Aldrich L6876-10G
Magnesium Chloride Sigma Aldrich 13152-1Kg
MERS-CoV synthetic RNA Twist Bioscience 103015
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL) Applied Biosystems 10310855
Mini- PROTEAN TGX Precast Gel Bio-Rad 456-1093
Miniprep kit Qiagen 27106
Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL Cytiva 17-3712-06
Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL Cytiva 17-5248-02
Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free Applied Biosystems 4311971
Potassium Chloride Fisher Bioreagents BP366-1
Primers and Probes Integrated DNA Technologies, Inc.
Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free Thermo Scientific A32955
Protein marker Fermentas 26616
RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex) Applied Biosystems
S.O.C medium Fisher Scientific 15544034
SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA Twist Bioscience 102024
Sf9 insect cells Gibco A35243
Sodium Chloride Sigma Aldrich S3014-1Kg
StrepTrap XT 5 mL Cytiva 29401323
Tetracycline IBI Scientific IB02200
Tris Base Molecular Biology Grade Promega H5135
Tris-HCl Affymetrix 22676
Tween 20 Sigma Aldrich P1379-100ml
X-Gal Invitrogen B1690
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Riferimenti

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Althobaiti, A., Hamdan, K., Sobhy, M. A., Rawas, R., Takahashi, M., Artyukh, O., Tehseen, M. Development of Multiplex Real-Time RT-qPCR Assays for the Detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and MERS-CoV. J. Vis. Exp. (201), e65822, doi:10.3791/65822 (2023).
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