JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Разработка мультиплексных ОТ-кПЦР-анализов в режиме реального времени для выявления SARS-CoV-2, гриппа A/B и БВРС-КоВ

Published: November 10, 2023
doi:
10.3791/65822
, , , , , ,
1Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE),King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

Summary

Мы представляем два собственных одноэтапных набора для ОТ-кПЦР на основе зондов для распространенных респираторных вирусов. Первый анализ проводится на SARS-CoV-2 (N), грипп A (H1N1 и H3N2) и грипп B. Второй — для SARS-Cov-2 (N) и MERS (UpE и ORF1a). Эти анализы могут быть успешно реализованы в любой специализированной лаборатории.

Abstract

Коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2), вызывающий коронавирусную болезнь 2019 года (COVID-19), представляет серьезную угрозу для здоровья населения в целом. Во время сезонов гриппа распространение SARS-CoV-2 и других респираторных вирусов может привести к тяжелому бремени респираторных заболеваний в масштабах всего населения, с которым трудно справиться. Для этого в предстоящие осенние и зимние сезоны необходимо будет тщательно следить за респираторными вирусами SARS-CoV-2, гриппа А, гриппа В и ближневосточного респираторного синдрома (БВРС-КоВ), особенно в случае SARS-CoV-2, гриппа А и гриппа В, которые имеют схожие эпидемиологические факторы, такие как восприимчивые популяции, способ передачи и клинические синдромы. Без таргетно-специфических анализов может быть сложно дифференцировать случаи этих вирусов из-за их сходства. Соответственно, чувствительный и таргетный мультиплексный анализ, который может легко дифференцировать эти вирусные мишени, будет полезен для практикующих врачей. В этом исследовании мы разработали анализ на основе ПЦР с обратной транскриптазой в режиме реального времени с использованием разработанного нами одноэтапного набора R3T RT-qPCR для одновременного выявления SARS-CoV-2, гриппа A, гриппа B и SARS-CoV-2, MERS-CoV. Имея всего 10 копий их синтетических РНК, мы можем успешно идентифицировать мишени SARS-CoV-2, гриппа A, гриппа B и MERS-CoV одновременно со 100% специфичностью. Этот анализ признан точным, надежным, простым, чувствительным и специфичным. Разработанный метод может быть использован в качестве оптимизированного диагностического анализа SARS-CoV-2, гриппа А, гриппа В и SARS-CoV-2, MERS-CoV в больницах, медицинских центрах и диагностических лабораториях, а также в исследовательских целях.

Introduction

Пандемия продолжающейся коронавирусной инфекции 2019 года (COVID-19) вызвана новым коронавирусом, известным как коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2)1. Из-за высокой заразности и способности SAR-CoV-2 к быстрой передаче пандемия COVID-19 возникла в городе Ухань (Китай) и быстро распространилась по всему миру. Это в конечном итоге привело к появлению респираторных дистресс-признаков и даже смерти 2,3,4. COVID-19 был объявлен пандемией более чем в 213 странах, ожидая резкого увеличения числа подтвержденных случаев, о чем свидетельствуют статьи, опубликованные различными научными исследованиями 3,5. COVID-19 передается в основном мелкими респираторными каплями, которые инфицированные люди выделяют в окружающую среду, а затем подвергаются воздействию уязвимых лиц при вдыхании или тесном контакте с зараженными поверхностями. При попадании этих капель на слизистую оболочку глаз, рта или носа человек может заразиться6. Статистические данные, опубликованные Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ), показывают, что во всем мире зарегистрировано более 76 миллионов подтвержденных случаев пандемии, из которых 7миллионов закончились смертельным исходом7. Таким образом, Организация Объединенных Наций классифицировала пандемию, вызванную COVID-19, как бедствие из-за ее прямого воздействия на жизнь миллиардов людей во всем мире и имеющего далеко идущие экономические, экологические и социальные последствия.

Инициативы в области общественного здравоохранения, включая тщательное тестирование, раннее выявление, отслеживание контактов и изоляцию заболевших, сыграли решающую роль в удержании этой пандемии под контролем 8,9,10,11. В зимние месяцы циркуляция других респираторных вирусов, таких как грипп А и В, с симптомами, похожими на COVID-19, затруднит выявление, отслеживание и изоляцию случаев COVID-19 на ранних стадиях. Каждый год вспышка гриппа А и В начинается поздней осенью или в начале января с предсказуемой сезонностью12. Вирусы SARS-CoV-2 и гриппа имеют множество общих эпидемиологических признаков. Кроме того, сходство между восприимчивыми популяциями, к которым относятся дети, пожилые люди, люди с ослабленным иммунитетом и лица с хроническими сопутствующими заболеваниями, такими как астма, хроническая обструктивная болезнь легких, сердечная и почечная недостаточность или диабет12,13. Эти вирусы не только являются общими для уязвимых групп населения, но и имеют пути передачи контактным и воздушно-капельнымпутем14. Ожидается, что пациенты, вероятно, могут заразиться более чем одним из этих респираторных вирусов по мере приближения сезона гриппа к14 годам. Для этого необходимо провести скрининг на SARS-CoV-2 и вирусы гриппа у пациентов с симптомами, прежде чем они будут изолированы. Проведение отдельных тестов на три вируса (SARS-CoV-2, грипп А и грипп В) невозможно из-за глобальной нехватки ресурсов для экстракции и диагностики нуклеиновых кислот. Для того, чтобы отсеять их все в одной реакции, необходимо разработать метод или тест.

Ближневосточный респираторный синдром (БВРС)-КоВ является членом семейства коронавирусов человека (CoV). Первые изоляты вируса БВРС-КоВ были получены от госпитализированного пациента в Саудовской Аравии, который умер в сентябре 2012 г. из-за острых респираторныхзаболеваний15. Имеются данные, свидетельствующие о том, что основным резервуарным хозяином БВРС-КоВ являются одногорбые верблюды. Было доказано, что вирусы инфицированных одногорбых верблюдов являются зоонозными и, таким образом, могут инфицировать человека16,17. Люди, инфицированные этим вирусом, могут передавать его другим людям при тесном контакте18. По состоянию на 26 января 2018 г. в мире зарегистрировано 2143 лабораторно подтвержденных случая инфицирования БВРС-КоВ, из которых 750 закончились смертельным исходом19. Наиболее типичными симптомами БВРС-КоВ являются кашель, лихорадка и одышка. Сообщалось также, что у инфицированных БВРС-КоВ проявляются симптомы пневмонии, диареи и желудочно-кишечного недуга20. В настоящее время не существует ни коммерческой вакцины, ни специфического лечения БВРС-КоВ. Поэтому оперативная и точная диагностика имеет важнейшее значение для предотвращения широкомасштабных вспышек БВРС-КоВ и дифференциации БВРС-КоВ от SARS-CoV-2.

На сегодняшний день предложено множество подходов к выявлению этих вирусов, таких как мультиплексная ОТ-ПЦР 21,22,23,24,25, CRISPR/Cas1226,27, CRISPR/Cas928 и CRISPR/Cas329, иммуноферментный анализбокового потока 30, бумажные биомолекулярные сенсоры31, тестирование SHERLOCK в одном котле32, ДНК-аптамер 33, петлево-опосредованный изотермический усиление (LAMP)19,34 и т.д. Каждый из вышеупомянутых методов имеет уникальные преимущества и недостатки с точки зрения чувствительности и специфичности. Среди этих методов наиболее распространенным является тест на основе амплификации нуклеиновых кислот: мультиплексная кОТ-ПЦР, который считается золотым стандартом диагностики SARS-CoV-2, гриппа A, гриппа B и MERS-CoV.

В этом исследовании мы разработали и оценили различные комбинации праймеров и зондов для эффективного, точного и одновременного обнаружения SARS-CoV-2, гриппа A, гриппа B и SARS-CoV-2, MERS-CoV с использованием стандартных синтетических вирусных РНК. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) рекомендует мультиплексные анализы, разработанные для генов-мишеней БВРС-КоВ или SARS-CoV-2. Эти гены, как правило, кодируют белки и комплексы, которые способствуют образованию комплекса репликации/транскрипции (RTC)35, такого как область в открытой рамке считывания 1a (ORF1a), которая используется для анализа на БВРС-КоВ. Кроме того, структурные белки кодируются генами, используемыми в диагностических анализах, такими как восходящая область гена оболочки (upE) и ген нуклеокапсида (N), которые используются для анализов на MERS-CoV и SARS-Cov-2 соответственно35,36. Мы использовали собственный одноэтапный набор RT-qPCR R3T для создания RT-qPCR для обнаружения вирусов37. Обнаружение вирусов, чувствительность, специфичность и динамический диапазон нашего набора для одноэтапной ОТ-кПЦР R3T и наборов праймеров были протестированы и оценены с использованием 10-кратных серийных разведений стандартных скрутенных синтетических РНК. Самый низкий практический предел обнаружения составлял примерно 10 копий расшифровки на реакцию. В результате для рутинной одновременной диагностики SARS-CoV-2, гриппа А, гриппа В и SARS-CoV-2, SARS-CoV-2, SARS-CoV-2, SARS-CoV-2, БВРС-КоВ можно успешно использовать и внедрять собственный одноэтапный набор для ОТ-кПЦР R3T.

Protocol

1. Экспрессия и очистка Taq-полимеразы Сконструировать плазмиду с расщепляемой гекса-гистидиновой меткой на С-конце фермента. Трансформируют 50 нг вектора экспрессии в штамм E. coli BL21-(DE3) в соответствии со стандартным протоколом38. Высевать трансфо…

Representative Results

В последние годы были достигнуты значительные успехи в диагностическом подходе к выявлению распространенных респираторных вирусов с использованием подходов ПЦР 21,22,23,24,25. Однако, несмотря на эти д…

Discussion

В связи с распространением распространенных респираторных вирусов, таких как SARS-CoV-2, грипп A/B и варианты БВРС-КоВ 12,19,20, на систему здравоохранения во всем мире ложится тяжелая экономическая нагрузка. Руководствуясь чувством ответствен…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Научно-технологическим университетом имени короля Абдаллы за счет основного финансирования и National Term Grand Challenge (NTGC) для S.M.H.

Materials

0.45 μm filter cups Thermo Scientific 291-4545
10X Tris-Glycine SDS running buffer Novex LC2675
6-well tissue culturing plates Corning 353046
Ammonium sulfate Fisher Scientific A701-3
Ampicillin Corning 61-238-RH
Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL Cytiva 17-1152-01
D-(+)-Biotin, 98+% Thermo Scientific A14207.60
DH10Bac competent cells Fisher Scientific 10361012
Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC) Thermo Scientific 68100
Dithiothreitol (DTT) Thermo Scientific R0862
Dnase/Rnase Free Distilled Water Ambion AM9930
dNTPs Thermo Scientific R0192
E. coli BL21(DE3) competent cells Invitrogen C600003
EDTA Fisher Scientific BP120-1
Elution Buffer Qiagen 19086
ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media) Expression Systems 96-001-01
FBS Solution Gibco A38400-01
Fugene (transfection reagent) Promega E2311
Gentamicin Fisher Scientific 15750060
Glycerol Sigma Aldrich G5516-500
IGEPAL CA-630 Sigma Aldrich I8896-100ml
Imidazole Sigma Aldrich 56750-1Kg
Influenza A (H1N1) synthetic RNA Twist Bioscience 103001
Influenza A (H3N2)  synthetic RNA Twist Bioscience 103002
Influenza B synthetic RNA Twist Bioscience 103003
IPTG Gold Biotechnology I3481C100
Kanamycin Gibco 11815-032
LB Agar Fisher Scientific BP1425-500
LB Broth media Fisher Scientific BP1426-500
Lysozyme Sigma Aldrich L6876-10G
Magnesium Chloride Sigma Aldrich 13152-1Kg
MERS-CoV synthetic RNA Twist Bioscience 103015
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL) Applied Biosystems 10310855
Mini- PROTEAN TGX Precast Gel Bio-Rad 456-1093
Miniprep kit Qiagen 27106
Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL Cytiva 17-3712-06
Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL Cytiva 17-5248-02
Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free Applied Biosystems 4311971
Potassium Chloride Fisher Bioreagents BP366-1
Primers and Probes Integrated DNA Technologies, Inc.
Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free Thermo Scientific A32955
Protein marker Fermentas 26616
RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex) Applied Biosystems
S.O.C medium Fisher Scientific 15544034
SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA Twist Bioscience 102024
Sf9 insect cells Gibco A35243
Sodium Chloride Sigma Aldrich S3014-1Kg
StrepTrap XT 5 mL Cytiva 29401323
Tetracycline IBI Scientific IB02200
Tris Base Molecular Biology Grade Promega H5135
Tris-HCl Affymetrix 22676
Tween 20 Sigma Aldrich P1379-100ml
X-Gal Invitrogen B1690
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nat Rev Microbiol. 19 (3), 141-154 (2021).
  2. Zhu, N., et al. A novel Coronavirus from patients with Pneumonia in China, 2019. N Engl J Med. 382 (8), 727-733 (2019).
  3. Huang, C., et al. Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. Lancet. 395 (10223), 497-506 (2020).
  4. Wu, F., et al. A new coronavirus associated with human respiratory disease in China. Nature. 579 (7798), 265-269 (2020).
  5. Yang, S., et al. Deep learning for detecting corona virus disease 2019 (COVID-19) on high-resolution computed tomography: a pilot study. Ann Transl Med. 8 (7), 450 (2020).
  6. El Hassan, M., et al. A review on the transmission of COVID-19 based on cough/sneeze/breath flows. Eur Phys J Plus. 137 (1), 1 (2022).
  7. . WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard Available from: https://covid19.who.int (2023)
  8. Kucharski, A. J., et al. Effectiveness of isolation, testing, contact tracing, and physical distancing on reducing transmission of SARS-CoV-2 in different settings: a mathematical modelling study. Lancet Infect Dis. 20 (10), 1151-1160 (2020).
  9. Reddy, K. P., et al. Cost-effectiveness of public health strategies for COVID-19 epidemic control in South Africa: a microsimulation modelling study. Lancet Glob Health. 9 (2), e120-e129 (2021).
  10. Cheng, H. Y., et al. Contact tracing assessment of COVID-19 transmission dynamics in Taiwan and risk at different exposure periods before and after symptom onset. JAMA Intern Med. 180 (9), 1156-1163 (2020).
  11. Kretzschmar, M. E., et al. Impact of delays on effectiveness of contact tracing strategies for COVID-19: a modelling study. Lancet Public Health. 5 (8), e452-e459 (2020).
  12. Krammer, F., et al. Influenza. Nat Rev Dis Primers. 4 (1), 3 (2018).
  13. Yang, J., et al. Prevalence of comorbidities and its effects in patients infected with SARS-CoV-2: a systematic review and meta-analysis. Int J Infect Dis. 94, 91-95 (2020).
  14. Lansbury, L., Lim, B., Baskaran, V., Lim, W. S. Co-infections in people with COVID-19: a systematic review and meta-analysis. J Infect. 81 (2), 266-275 (2020).
  15. Zaki, A. M., van Boheemen, S., Bestebroer, T. M., Osterhaus, A. D., Fouchier, R. A. Isolation of a novel coronavirus from a man with pneumonia in Saudi Arabia. N Engl J Med. 367 (19), 1814-1820 (2012).
  16. Azhar, E. I., et al. Evidence for camel-to-human transmission of MERS coronavirus. N Engl J Med. 370 (26), 2499-2505 (2014).
  17. Ling, Y., Qu, R., Luo, Y. Clinical analysis of the first patient with imported Middle East respiratory syndrome in China. Zhonghua Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue. 27 (8), 630-634 (2015).
  18. Nazer, R. I. Outbreak of Middle East Respiratory Syndrome-Coronavirus causes high fatality after cardiac operations. Ann Thorac Surg. 104 (2), e127-e129 (2017).
  19. Huang, P., et al. A rapid and specific assay for the detection of MERS-CoV. Front Microbiol. 9, 1101 (2018).
  20. Ezhilan, M., Suresh, I., Nesakumar, N. SARS-CoV, MERS-CoV and SARS-CoV-2: A diagnostic challenge. Measurement (Lond). 168, 108335 (2021).
  21. Ulloa, S., et al. A simple method for SARS-CoV-2 detection by rRT-PCR without the use of a commercial RNA extraction kit. J Virol Methods. 285, 113960 (2020).
  22. Kudo, E., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA by multiplex RT-qPCR. PLoS Biol. 18 (10), e3000867 (2020).
  23. Norz, D., Hoffmann, A., Aepfelbacher, M., Pfefferle, S., Lutgehetmann, M. Clinical evaluation of a fully automated, laboratory-developed multiplex RT-PCR assay integrating dual-target SARS-CoV-2 and influenza A/B detection on a high-throughput platform. J Med Microbiol. 70 (2), 001295 (2021).
  24. Yun, J., et al. Evaluation of three multiplex real-time reverse transcription PCR assays for simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and Respiratory Syncytial virus in nasopharyngeal swabs. J Korean Med Sci. 36 (48), e328 (2021).
  25. Lu, X., et al. Real-time reverse transcription-PCR assay panel for Middle East respiratory syndrome coronavirus. J Clin Microbiol. 52 (1), 67-75 (2014).
  26. Broughton, J. P., et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol. 38 (7), 870-874 (2020).
  27. Ali, Z., et al. iSCAN: An RT-LAMP-coupled CRISPR-Cas12 module for rapid, sensitive detection of SARS-CoV-2. Virus Res. 288, 198129 (2020).
  28. Ali, Z., et al. Bio-SCAN: A CRISPR/dCas9-based lateral flow assay for rapid, specific, and sensitive detection of SARS-CoV-2. ACS Synth Biol. 11 (1), 406-419 (2022).
  29. Yoshimi, K., et al. CRISPR-Cas3-based diagnostics for SARS-CoV-2 and Influenza virus. iScience. 25 (2), 103830 (2022).
  30. Chen, Z., et al. Rapid and sensitive detection of anti-SARS-CoV-2 IgG, using Lanthanide-doped nanoparticles-based lateral flow immunoassay. Anal Chem. 92 (10), 7226-7231 (2020).
  31. Kasetsirikul, S., et al. Detection of the SARS-CoV-2 humanized antibody with paper-based ELISA. Analyst. 145 (23), 7680-7686 (2020).
  32. Joung, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK One-Pot testing. N Engl J Med. 383 (15), 1492-1494 (2020).
  33. Chen, Z., Wu, Q., Chen, J., Ni, X., Dai, J. A DNA aptamer based method for detection of SARS-CoV-2 nucleocapsid protein. Virol Sin. 35 (3), 351-354 (2020).
  34. Jang, W. S., et al. Development of a multiplex Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) assay for on-site diagnosis of SARS CoV-2. PLoS One. 16 (3), e0248042 (2021).
  35. McBride, R., Fielding, B. C. The role of Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS)-Coronavirus accessory proteins in virus pathogenesis. Viruses-Basel. 4 (11), 2902-2923 (2012).
  36. AlBalwi, M. A., et al. Evolving sequence mutations in the Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV). J Infection Public Health. 13 (10), 1544-1550 (2020).
  37. Takahashi, M., et al. Quick and easy assembly of a One-Step qRT-PCR Kit for COVID-19 diagnostics using In-House enzymes. ACS Omega. 6 (11), 7374-7386 (2021).
  38. Sambrook, J., Fritsch, E. R., Maniatis, T. . Molecular cloning: A laboratory manual (2nd ed.). , (1989).
  39. Simpson, R. J. SDS-PAGE of Proteins. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
  40. Simpson, R. J. Staining proteins in gels with Coomassie blue. CSH Protoc. 2007, (2007).
  41. Takumi Yano, J. M. L., et al. Expression of the thermostable Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase by silkworm-baculovirus expression system. J Asia-Pac Entomol. 22 (2), 453-457 (2019).
  42. van Kasteren, P. B., et al. Comparison of seven commercial RT-PCR diagnostic kits for COVID-19. J Clin Virol. 128, 104412 (2020).
  43. Shu, B., et al. Multiplex Real-Time reverse transcription PCR for Influenza A virus, Influenza B virus, and Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2. Emerg Infect Dis. 27 (7), 1821-1830 (2021).
  44. Engelke, D. R., Krikos, A., Bruck, M. E., Ginsburg, D. Purification of Thermus aquaticus DNA polymerase expressed in Escherichia coli. Anal Biochem. 191 (2), 396-400 (1990).
  45. Pabbaraju, K., Wong, A. A., Ma, R., Zelyas, N., Tipples, G. A. Development and validation of a multiplex reverse transcriptase-PCR assay for simultaneous testing of Influenza A, Influenza B and SARS-CoV-2. J Virol Methods. 293, 114151 (2020).
  46. Hirotsu, Y., et al. Analysis of COVID-19 and non-COVID-19 viruses, including Influenza viruses, to determine the influence of intensive preventive measures in Japan. J Clin Virol. 132, 104634 (2020).
  47. Sellner, L. N., Coelen, R. J., Mackenzie, J. S. Reverse-Transcriptase inhibits Taq Polymerase-Activity. Nucleic Acids Res. 20 (7), 1487-1490 (1992).

Tags

SARS-CoV-2Influenza AInfluenza BMERS-CoVMultiplex Real-time RT-qPCRRespiratory VirusesIn-house Developed R3T One-step RT-qPCR KitDiagnostic AssaySimultaneous DetectionSensitivitySpecificity
check_url/it/65822?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Althobaiti, A., Hamdan, K., Sobhy, M. A., Rawas, R., Takahashi, M., Artyukh, O., Tehseen, M. Development of Multiplex Real-Time RT-qPCR Assays for the Detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and MERS-CoV. J. Vis. Exp. (201), e65822, doi:10.3791/65822 (2023).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image