Ex vivo Calcium Imaging for Drosophila Model af epilepsi
Summary
Her præsenterer vi en protokol for ex vivo calciumbilleddannelse i GCaMP6-ekspresserende voksen Drosophila til overvågning af epileptiforme aktiviteter. Protokollen giver et værdifuldt værktøj til undersøgelse af ictale hændelser hos voksne Drosophila gennem ex vivo calciumbilleddannelse, hvilket giver mulighed for udforskning af de potentielle mekanismer for epilepsi på celleniveau.
Abstract
Epilepsi er en neurologisk lidelse karakteriseret ved tilbagevendende anfald, delvist korreleret med genetisk oprindelse, der påvirker over 70 millioner individer over hele verden. På trods af den kliniske betydning af epilepsi mangler den funktionelle analyse af neural aktivitet i centralnervesystemet stadig at blive udviklet. Nylige fremskridt inden for billeddannelsesteknologi i kombination med stabil ekspression af genetisk kodede calciumindikatorer, såsom GCaMP6, har revolutioneret undersøgelsen af epilepsi på både hjernedækkende og enkeltcelleopløsningsniveauer. Drosophila melanogaster er opstået som et værktøj til at undersøge de molekylære og cellulære mekanismer, der ligger til grund for epilepsi på grund af dets sofistikerede molekylære genetik og adfærdsmæssige assays. I denne undersøgelse præsenterer vi en ny og effektiv protokol til ex vivo calciumbilleddannelse i GCaMP6-ekspresserende voksen Drosophila til overvågning af epileptiforme aktiviteter. Hele hjernen er fremstillet af cac, et velkendt epilepsi-gen, knockdown-fluer til calciumbilleddannelse med et konfokalmikroskop for at identificere den neurale aktivitet som opfølgning på det bang-følsomme anfaldslignende adfærdsassay. Cac knockdown-fluerne viste en højere anfaldslignende adfærd og unormale calciumaktiviteter, herunder flere store pigge og færre små pigge end vildtypefluer. Kalciumaktiviteterne var korreleret med anfaldslignende adfærd. Denne metode fungerer som en effektiv metode til screening af de patogene gener for epilepsi og udforskning af den potentielle mekanisme for epilepsi på celleniveau.
Introduction
Epilepsi, en kompleks kronisk neurologisk lidelse karakteriseret ved gentagelse af spontane og uprovokerede anfald og afvigende neuronal netværksaktivitet, har påvirket over 70 millioner individer over hele verden, hvilket gør det til en af de mest almindelige neurologiske sygdomme1 og fører til de tunge byrder for familier og samfund. I betragtning af virkningen af epilepsi er der udført mange undersøgelser for at identificere ætiologien af anfald, hvoraf genetik er blevet godkendt som en primær årsag til mange typer epilepsier eller epileptiske syndromer2. I de seneste årtier har fremskridt inden for genomiske teknologier ført til en hurtig stigning i opdagelsen af nye epilepsiassocierede gener, som spiller en afgørende rolle i forekomsten af anfald, herunder ionkanaler og ikke-ionkanalgener 3,4. Imidlertid forstås de underliggende mekanismer og funktionel analyse mellem generne og epileptiske fænotyper ufuldstændigt. Identifikation af epilepsiassocierede gener og mekanismer giver mulighed for effektiv behandling af patienter 5,6.
Cytosoliske calciumsignaler er centrale elementer i neuronal aktivitet og synaptisk transmission. Calciumbilleddannelse, herunder hjerneskiver7, in vivo 8,9 og ex vivo10, er blevet brugt til at overvåge neuronal aktivitet11 som markør for neuronal excitabilitet siden 1970’erne12,13. Nylige fremskridt inden for billeddannelsesteknologi i kombination med de genetisk kodede calciumindikatorer (GECI’er), såsom GCaMP6, har revolutioneret undersøgelsen af epilepsi på både hjernedækkende og enkeltcelleopløsningsniveauer 14,15,16, som har et højt niveau af rumlig tidsmæssig præcision. Ændringer i calciumkoncentration og transienter blev observeret i henholdsvis aktionspotentialer og synaptisk transmission14, hvilket indikerer, at ændringen af intracellulære calciumniveauer udviser en streng korrelation med neuronernes elektriske excitabilitet17,18. Calciumbilleddannelse er også blevet anvendt som en udviklingsbeslaglæggelsesmodel9 og udført i Drosophila til screening af antikonvulsive forbindelser19.
Drosophila melanogaster har været ved at fremstå som en stærk modelorganisme i videnskabelig forskning, såsom epilepsi, for sin sofistikerede molekylære genetik og adfærdsmæssige assays 20,21,22. Desuden har de avancerede genetiske værktøjer i Drosophila bidraget til ekspressionen af genetisk kodet calciumindikator GCaMP6. For eksempel muliggør de Gal4- og UAS-baserede binære transkriptionssystemer specifikt udtryk for GCaMP6 på en rumligt og tidsmæssigt kontrolleret måde. Da Drosophila er en lille organisme, kræver in vivo calciumbilleddannelse dygtige operationsfærdigheder for at udføre et kirurgisk indgreb, hvor kun en lille del af hjernens dorsal blev udsat gennem et lille vindue14,23. Samtidig kan ex vivo calciumbilleddannelse i den intakte hjerne af Drosophila bruges til at overvåge interesseområderne (ROI’er) i hele hjernen.
I denne undersøgelse præsenterer vi ex vivo calciumbilleddannelse i GCaMP6-ekspresserende voksen Drosophila for at overvåge epileptiforme aktiviteter. CACNA1A er et velkendt epilepsi-gen, tilhører cac Cav2-kanalen, som er en homolog til CACNA1A. Vi begyndte med at dissekere hjernen hos cac knockdown fluer tub-Gal4>GCaMP6m / cac-RNAi og billeddannelse dem ved hjælp af et konfokalmikroskop med xyt scanningstilstand. Vi analyserede derefter ændringerne i calciumsignaler for ROI’er ved at beregne indikatorer, der kvantificerer spontane anfaldslignende hændelser, såsom% ΔF / F-værdi og calciumhændelser af GCaMP6-fluorescens. Derudover udførte vi mekanisk stimulus af hvirvelmaskine for også at fremkalde anfaldsadfærdstest på cac-knockdown-fluer for at validere resultaterne af calciumbilleddannelse. Samlet set giver denne protokol et værdifuldt værktøj til undersøgelse af ictale hændelser hos voksne Drosophila gennem ex vivo calciumbilleddannelse, hvilket giver mulighed for udforskning af de potentielle mekanismer for epilepsi på celleniveau.
Protocol
Representative Results
Discussion
Calciumionen fungerer som en afgørende anden budbringer, der spiller en afgørende rolle i en række fysiologiske og patofysiologiske reaktioner på både kemiske og elektriske forstyrrelser. Desuden er det topologiske element i de præsynaptiske P / Q-kanaler, kodet af det humane CACNA1A gen, blevet identificeret som ansvarlig for formidling af udledningen af forskellige neurotransmittere, herunder glutamat 30,31,32, og er tæt forbundet med epilepsi<s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (bevilling nr. 2022A1515111123 til Jing-Da Qiao) og planlægger at forbedre videnskabelig forskning i GMU (Jing-Da Qiao). Dette arbejde blev også støttet af Guangzhou Medical University Student Innovation Ability Enihancement Plan (finansiering nr. 02-408-2304-02038XM).
Materials
| Brushes | Panera | AAhc022-2 | for handling flies |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Confocal microscope | SP8; Zeiss, Jena, Germany. | N/A | for calcium imaging |
| CO2 anesthesia machine | N/A | N/A | for Anesthetizing the flies. |
| C-sharp holder | N/A | N/A | handmade, for mounting the brain |
| Culture vials | Biologix | 51-0500 | 2.5 cm diameter, 9.5 cm height |
| Fiji software | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | version: 2.14.0 | for analysis |
| Fly morgue | N/A | N/A | handmade, for handling flies |
| Fly stocks | cac-RNAi | 27244 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | GCaMP6m | 42750 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | tub-Gal4 | N/A | from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| High-resolution camera | N/A | N/A | for recording the seizure-like behavior assay |
| L-lysine | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Magnesium chloride solution (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Papain suspension | Worthington Biochemical | LS003126 | |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | SLW1480/02D | for dissection |
| Pipette | Thermo Scientific | 4640010, 4640030, 4640050, 4640060 | for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Recording dish | Thermo Scientific | 150682- Glass Based Dish | for holding the brain and calcium imaging |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S25550 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| Stereo-binocular microscope | SHANG GUANG | XTZ-D | for handling flies and dissection |
| Syringe needles | pythonbio | HCL0693 | for dissection |
| Tripod | WEIFENG | 45634732523 | for recording the seizure-like behavior assay |
| Vortex mixer | Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich | Z653438 | for performing the seizure-like behavior assay |
| Whiteboard | N/A | N/A | handmade, foam pad or paper for background |
Riferimenti
- Thijs, R. D., Surges, R., O’brien, T. J., Sander, J. W. Epilepsy in adults. Lancet. 393 (10172), 689-701 (2019).
- Ellis, C. A., Petrovski, S., Berkovic, S. F. Epilepsy genetics: Clinical impacts and biological insights. Lancet Neurol. 19 (1), 93-100 (2020).
- Wang, J., et al. Epilepsy-associated genes. Seizure. 44, 11-20 (2017).
- Oliver, K. L., et al. Genes4epilepsy: An epilepsy gene resource. Epilepsia. 64 (5), 1368-1375 (2023).
- Rogawski, M. A., Loscher, W., Rho, J. M. Mechanisms of action of antiseizure drugs and the ketogenic diet. Cold Spring Harb Perspect Med. 6 (5), 022780 (2016).
- Ademuwagun, I. A., Rotimi, S. O., Syrbe, S., Ajamma, Y. U., Adebiyi, E. Voltage gated sodium channel genes in epilepsy: Mutations, functional studies, and treatment dimensions. Front Neurol. 12, 600050 (2021).
- Leweke, F. M., Louvel, J., Rausche, G., Heinemann, U. Effects of pentetrazol on neuronal activity and on extracellular calcium concentration in rat hippocampal slices. Epilepsy Res. 6 (3), 187-198 (1990).
- Yang, W., Yuste, R. In vivo imaging of neural activity. Nat Methods. 14 (4), 349-359 (2017).
- Hewapathirane, D. S., Dunfield, D., Yen, W., Chen, S., Haas, K. In vivo imaging of seizure activity in a novel developmental seizure model. Exp Neurol. 211 (2), 480-488 (2008).
- Ishimoto, H., Sano, H. Ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in drosophila. J Vis Exp. 136, 57701 (2018).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Moisescu, D. G., Ashley, C. C., Campbell, A. K. Comparative aspects of the calcium-sensitive photoproteins aequorin and obelin. Biochim Biophys Acta. 396 (1), 133-140 (1975).
- Blinks, J. R., Prendergast, F. G., Allen, D. G. Photoproteins as biological calcium indicators. Pharmacol Rev. 28 (1), 1-93 (1976).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved gcamp calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Svoboda, K., Helmchen, F., Denk, W., Tank, D. W. Spread of dendritic excitation in layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex in vivo. Nat Neurosci. 2 (1), 65-73 (1999).
- Rochefort, N. L., Jia, H., Konnerth, A. Calcium imaging in the living brain: Prospects for molecular medicine. Trends Mol Med. 14 (9), 389-399 (2008).
- Russell, J. T. Imaging calcium signals in vivo: A powerful tool in physiology and pharmacology. Br J Pharmacol. 163 (8), 1605-1625 (2011).
- Neher, E., Sakaba, T. Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release. Neuron. 59 (6), 861-872 (2008).
- Streit, A. K., Fan, Y. N., Masullo, L., Baines, R. A. Calcium imaging of neuronal activity in drosophila can identify anticonvulsive compounds. PLoS One. 11 (2), 0148461 (2016).
- Parker, L., Howlett, I. C., Rusan, Z. M., Tanouye, M. A. Seizure and epilepsy: Studies of seizure disorders in drosophila. Int Rev Neurobiol. 99, 1-21 (2011).
- Del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in drosophila. Nat Methods. 9 (1), 47-55 (2011).
- Liu, C. Q., et al. Efficient strategies based on behavioral and electrophysiological methods for epilepsy-related gene screening in the drosophila model. Front Mol Neurosci. 16, 1121877 (2023).
- Wang, Y., et al. Genetic manipulation of the odor-evoked distributed neural activity in the drosophila mushroom body. Neuron. 29 (1), 267-276 (2001).
- Wang, J., et al. Unc13b variants associated with partial epilepsy with favourable outcome. Brain. 144 (10), 3050-3060 (2021).
- Ganetzky, B., Wu, C. F. Indirect suppression involving behavioral mutants with altered nerve excitability in drosophila melanogaster. Genetica. 100 (4), 597-614 (1982).
- Roemmich, A. J., Schutte, S. S., O’dowd, D. K. Ex vivo whole-cell recordings in adult drosophila brain. Bio Protoc. 8 (14), 2467 (2018).
- Gu, H., O’dowd, D. K. Whole cell recordings from brain of adult drosophila. J Vis Exp. (6), 248 (2007).
- Qiao, J., Yang, S., Geng, H., Yung, W. H., Ke, Y. Input-timing-dependent plasticity at incoming synapses of the mushroom body facilitates olfactory learning in drosophila. Curr Biol. 32 (22), 4869-4880 (2022).
- Liu, C. -. Q., Lin, Y. -. M., Zhang, X. -. X., Peng, R. -. C., Qiao, J. -. D. Protective effect of CACNA1A deficiency against seizure in the CACNA1A-CELSR2 digenic knockdown flies. Research Square. , (2023).
- Uchitel, O. D., Inchauspe, C. G., Urbano, F. J. D. i., Guilmi, M. N. Cav2.1 voltage activated calcium channels and synaptic transmission in familial hemiplegic migraine pathogenesis. J Physiol Paris. 106 (1-2), 12-22 (2012).
- Le Roux, M., et al. Cacna1a-associated epilepsy: Electroclinical findings and treatment response on seizures in 18 patients. Eur J Paediatr Neurol. 33, 75-85 (2021).
- Alehabib, E., et al. Clinical and molecular spectrum of p/q type calcium channel cav2.1 in epileptic patients. Orphanet J Rare Dis. 16 (1), 461 (2021).
- Li, X. L., et al. Cacna1a mutations associated with epilepsies and their molecular sub-regional implications. Front Mol Neurosci. 15, 860662 (2022).
- Indelicato, E., Boesch, S. From genotype to phenotype: Expanding the clinical spectrum of cacna1a variants in the era of next generation sequencing. Front Neurol. 12, 639994 (2021).
- Saras, A., Tanouye, M. A. Mutations of the calcium channel gene cacophony suppress seizures in drosophila. Plos Genetics. 12 (1), e1005784 (2016).
- Cozzolino, O., et al. Evolution of epileptiform activity in zebrafish by statistical-based integration of electrophysiology and 2-photon ca2+ imaging. Cells. 9 (3), 769 (2020).
- Mituzaite, J., Petersen, R., Claridge-Chang, A., Baines, R. A. Characterization of seizure induction methods in drosophila. eNeuro. 8 (4), (2021).
- Miller, D. E., Cook, K. R., Hawley, R. S. The joy of balancers. Plos Genetics. 15 (11), e1008421 (2019).
