Denne protokol beskriver en opsætning til krystallisering af steroltransportøren ABCG5/G8. ABCG5/G8 rekonstitueres til biceller til hanging-drop krystallisering. Protokollen kræver ikke specialiserede materialer eller substrater, hvilket gør den tilgængelig og nem at tilpasse i ethvert laboratorium til bestemmelse af proteinstrukturen gennem røntgenkrystallografi.
ATP-bindende kassettetransportører (ABC) udgør lipidindlejrede membranproteiner. Ekstraktion af disse membranproteiner fra lipiddobbeltlaget til et vandigt miljø opnås typisk ved at anvende vaskemidler. Disse vaskemidler opløser lipiddobbeltlaget og opløser proteinerne. Membranproteinernes iboende habitat i lipiddobbeltlaget udgør en udfordring med at opretholde deres stabilitet og ensartethed i opløsning til strukturel karakterisering. Biceller, som omfatter en blanding af lange og kortkædede fosfolipider og vaskemidler, replikerer den naturlige lipidstruktur. Anvendelsen af lipidbiceller og vaskemidler tjener som et passende modelsystem til opnåelse af diffraktionskrystaller af høj kvalitet, specifikt til bestemmelse af membranproteiners højopløsningsstruktur. Gennem disse syntetiske mikromiljøer bevarer membranproteiner deres oprindelige konformation og funktionalitet, hvilket letter dannelsen af tredimensionelle krystaller. I denne tilgang blev den vaskemiddelopløselige heterodimeriske ABCG5 / G8 reintegreret i DMPC / CHAPSO-biceller, suppleret med kolesterol. Denne opsætning blev anvendt i dampdiffusionseksperimentproceduren til proteinkrystallisation.
ATP-bindende kassettetransportører (ABC) udgør en superfamilie af membranproteiner, der er ansvarlige for forskellige ATP-afhængige transportprocesser på tværs af biologiske membraner 1,2,3,4,5. Disse transportørproteiner er impliceret i hjerte-kar-sygdomme og spiller en væsentlig rolle i at lette kolesteroludstrømning til galden til efterfølgende udskillelse i leveren. Derfor har kolesterolmetabolisme og balance fået betydelig interesse gennem årene6. En specifik mekanisme, der er involveret i eliminering af kolesterol og andre steroler fra kroppen, involverer medlemmer af den humane ABCG-underfamilie, især den heterodimeriske ABCG5/G8 7,8,9,10. Mutationer i et af disse gener forstyrrer heterodimeren, hvilket fører til tab af funktion og forårsager sitosterolæmi, en lidelse, der påvirker sterolhandel11,12,13. I betragtning af sygdommens relevans og deres rolle i at fremme kolesteroludstrømning har steroltransportører tiltrukket sig betydelig opmærksomhed. Ikke desto mindre forbliver de indviklede detaljer om deres molekylære mekanisme og substratselektivitet stort set ikke afsløret. Således er belysningen af krystalstrukturen i ABCG5 / G8 et afgørende skridt mod at forstå mekanismerne og nedstrøms funktioner i kolesteroltransport.
Membranproteiner kræver forankring i membraner for at folde og fungere korrekt. Derfor resulterer ekstraktion af membranproteiner fra deres naturlige miljø ofte i proteinstabilitet, fejlfoldning og tab af funktion14,15. Disse udfordringer understreger de primære forhindringer i membranproteinkrystallisering. Imidlertid har rekonstitution af proteiner til syntetiske vaskemiddel-dobbeltlag, ligesom biceller, vist sig at være en løsning på denne knibe, hvilket muliggør vedligeholdelse af membranproteiner inden for et naturligt lignende dobbeltlagsmiljø16. Biceller er samlinger af syntetiske fosfolipider og vaskemidler suspenderet og opløseligt i vand. Især vedtager de en dobbeltlagsstruktur, der efterligner biologiske membraner16,17,18. Biceller kan skifte mellem væske- og gelfaser baseret på temperatur og viskositet. Bicellekrystallisering udnytter de små dobbeltlagsskiver og lav viskositet ved reducerede temperaturer, hvilket letter grundig blanding af proteiner og bicelleopløsninger. Bicellernes størrelse afhænger af forholdet mellem vaskemiddel og lipid under tilberedning19,20. De fremherskende vaskemidler til bicelledannelse omfatter 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-2-hydroxy-1-propansulfonat (CHAPSO) sammen med 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat (CHAPS) og 1,2-ditridecanoyl-sn-glycerol-3-phosphocholin (DHPC)21. Disse vaskemidler anvendes sammen med lipider såsom di-myristoyl-phosphatidylcholin (DMPC) og 1-palmitoyl-2-oleoyl-phosphatidylcholin (POPC). Desuden har nylige undersøgelser vist den fulde funktionalitet af membranproteiner i biceller under fysiologiske forhold. For eksempel krystalliserede Lee og kolleger med succes og rapporterede krystalstrukturen af ABCG5 / ABCG8 baseret på et lipid dobbeltlag22,23. I krystallisationsprocessen kan protein-bicelleblandinger rummes ved hjælp af standardudstyr, herunder krystallisationsrobotter med høj kapacitet24. Muligheden for at udnytte biceller afhænger imidlertid af proteinernes termostabilitet på grund af krystalliseringsbetingelserne ved højere temperaturer. Ikke desto mindre, sammenlignet med andre teknikker, forbliver de nødvendige krystalliseringsbetingelser for membranproteiner generelt milde, hvilket involverer lave koncentrationer af bundfald, salt og buffer. Dette gør både protein-bicelleblandinger og dampdiffusion effektive og let implementerbare værktøjer til strukturelle undersøgelser af membranproteiner.
Denne protokol skitserer væsentlige trin i proteinforberedelse og bicellekrystallisation til bestemmelse af røntgenkrystalstrukturen af ABCG5 / G8 ved høj opløsning (figur 1).
Udfordringerne forbundet med krystallisering af membranproteiner har ført til udvikling af lipid-dobbeltlagsdrevne krystalliseringsmetoder, såsom bicelle27 eller lipidkubisk fase (LCP)14 tilgange. At opnå en vellykket krystallisering af membranproteiner afhænger dog stadig af det kritiske og undertiden flaskehalsede trin i proteinpræparationen. Især ABC-transportører udgør en formidabel forhindring i voksende krystaller, der er egnede til røntgenkrystallografi. Denne protokol giver omfattende praktisk vejledning til strømlining af forberedelsen af human ABCG5/G8 steroltransportør og fremme af krystalvækst gennem bicellekrystalliseringsmetoden.
En vigtig overvejelse ved udarbejdelsen af denne protokol var nødvendigheden af et betydeligt proteinudbytte i de indledende faser af proteinoprensning, hvilket muliggjorde en vis grad af proteintab under prækrystallisationsbehandling (figur 3). Fælles strategier til løsning af denne udfordring involverer omfattende proteinteknik, udnyttelse af forskellige ekspressionsværter og udforskning af ortologer eller homologer, blandt andre tilgange. Ikke desto mindre er der med denne tilsyneladende indviklede procedure identificeret en række afgørende trin, der understøtter protokollens succes og også giver indsigt i potentielle begrænsninger, der kan opstå, når man studerer andre ABC-transportører eller membranproteiner generelt.
For det første anvender denne protokol grundig centrifugering på hvert trin for at minimere proteinaggregering. Derudover er kontinuerlig overvågning af termostabiliteten af de oprensede proteiner afgørende. Elektronmikroskopi bruges til at verificere proteinmonodispersitet, mens analytisk gelfiltrering sporer proteinstabilitet over tid (figur 2). Alternative teknikker som cirkulær dikroisme (CD) eller differentiel scanningskalorimetri (DSC) kunne også indarbejdes. Desuden er inkorporeringen af lipider på specifikke stadier afgørende for at maksimere både aktiviteten og krystallogenesen af den rensede ABCG5/G8. For eksempel er cholat og CHS nødvendige for at udvise målbar ATP-hydrolyse; fosfolipider er uundværlige for at opretholde stabiliteten af methylerede proteiner; og kolesterol er en nødvendig komponent i bicelleopløsningen, der fremmer krystalvækst, der er egnet til røntgendiffraktion med høj opløsning (figur 4).
I det væsentlige kan hele proceduren udføres inden for en uges indsats. I modsætning til LCP er hentning af krystaller fra krystalliseringsbakker med hængende dråbe ligetil. Fremadrettet er denne protokol med et betydeligt proteinudbytte (ca. 10 mg) let at tilpasse til udvikling af krystallografiske undersøgelser, der involverer ABCG5/G8-mutanter eller andre transportørproteiner. Dette er især relevant for tilfælde, der i øjeblikket undgår visualisering gennem elektronmikroskopi.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde er støttet af et Natural Sciences and Engineering Research Council Discovery Grant (RGPIN 2018-04070) og et Canadian Institutes of Health Research Project Grant (PJT-180640) til JYL. Denne protokol er baseret på de oprindelige rapporter i ABCG5/G8 krystalstrukturer rapporteret tidligere af Farhat et al.22 og Lee et al.23.
(NH4)2SO4 | MilliporeSigma | A4915 | |
ABCG5 | National Institute of Health collection | NCBI accession number NM_022436 | |
ABCG8 | National Institute of Health collection | NCBI accession number NM_022437 | |
ÄKTA FPLC system | Cytiva (formerly GE Healthcare Life Sciences) | ||
CaCl2 | Wisent | 600-024-CG | Anhydrous |
CBP | Agilent | 214303 | Calmodulin binding peptide affinity resin |
Centrifugal concentrators (Vivaspin) | Sartorius | ||
CHAPSO | Anatrace | C317 | Anagrade |
Cholesterol | Anatrace | CH200 | |
CHS | Steraloids | C6823-000 | |
DMAB | MilliporeSigma | 180238 | 97% |
DMNG | Anatrace | NG322 | |
DMPC | Anatrace | D514 | |
DOPC | Avanti | 850375 | |
DOPC | Anatrace | D518 | |
DOPE | Avanti | 850725 | |
DTT | Fisher | BP172 | |
Dual Thickness MicroLoops | MiTeGen | ||
EDTA | BioShop | EDT003 | Disodium salt, dihydrate |
EGTA | MilliporeSigma | 324626 | |
Emulsifier (EmulsiFex-C3) | Avestin | ||
Endo H | New England Biolabs | P0702 | |
Ethanol | Greenfield | P016EAAN | Ethyl Alcohol Anhydrous |
Formaldehyde | MilliporeSigma | 252549 | ACS Reagent |
Glycerol | BioShop | GLY004 | |
HEPES | BioShop | HEP001 | |
HRV-3C protease | Homemade | ||
Imidazole | BioShop | IMD510 | Reagent grade |
Iodoacetamide | MilliporeSigma | I1149 | BioUltra |
Isopropanol | Fisher | BP2618212 | |
Leupeptin | BioShop | LEU001 | |
MES | MilliporeSigma | 69892 | BioUltra |
Methanol | Fisher | A412P | |
MgCl2 | Wisent | 800-070-CG | Hydrated |
microfluidizer (LM 20) | Microfluidics | ||
NaCl | BioShop | SOD002 | |
NH4OH | Fisher | A669-212 | ACS Reagent |
Ni-NTA superflow | Qiagen | 30430 | Nickel-charged resins |
PEG 400 | MilliporeSigma | 202398 | |
Pepstatin | BioShop | PEP605 | |
PMSF | MilliporeSigma | P7626 | |
pSGP18 and pLIC | Homemade (derived from pPICZ, Invitrogen) | ||
SDS | BioShop | SDS003 | |
Sodium cholate | Fisher | 229101 | |
Sodium malonate | MilliporeSigma | 63409 | |
Sucrose | Wisent | 800-081-WG | Ultra pure |
Superdex 200 30/100 GL | Cytiva (formerly GE Healthcare Life Sciences) | 28990944 | Prepacked gel-filtration column |
TCEP | |||
TEM | FEI, Technai | ||
Tris Base | Fisher | BP152 | |
β-DDM | Anatrace | D310S | Sol Grade |
β-mercaptoethanol | MilliporeSigma | ||
ε-aminocaproic acid | Fisher | AAA1471936 |