यह प्रोटोकॉल स्टेरोल ट्रांसपोर्टर ABCG5/G8 के क्रिस्टलीकरण के लिए एक सेटअप का वर्णन करता है। ABCG5/G8 को हैंगिंग-ड्रॉप क्रिस्टलीकरण के लिए बाइसेल में पुनर्गठित किया जाता है। प्रोटोकॉल विशेष सामग्री या सब्सट्रेट की आवश्यकता नहीं है, यह सुलभ और आसान एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी के माध्यम से प्रोटीन संरचना का निर्धारण करने के लिए किसी भी प्रयोगशाला में अनुकूलन करने के लिए कर रही है.
एटीपी-बाइंडिंग कैसेट (एबीसी) ट्रांसपोर्टर लिपिड-एम्बेडेड झिल्ली प्रोटीन का गठन करते हैं। लिपिड बाइलेयर से इन झिल्ली प्रोटीन को एक जलीय वातावरण में निकालना आमतौर पर डिटर्जेंट को नियोजित करके प्राप्त किया जाता है। ये डिटर्जेंट लिपिड बाइलेयर को विघटित करते हैं और प्रोटीन को घुलनशील करते हैं। लिपिड बाइलेयर के भीतर झिल्ली प्रोटीन का आंतरिक निवास संरचनात्मक लक्षण वर्णन के समाधान में उनकी स्थिरता और एकरूपता बनाए रखने में एक चुनौती है। बाइसेल, जिसमें लंबी और छोटी श्रृंखला फॉस्फोलिपिड और डिटर्जेंट का मिश्रण होता है, प्राकृतिक लिपिड संरचना को दोहराता है। लिपिड बाइसेल और डिटर्जेंट का उपयोग उच्च गुणवत्ता वाले विवर्तन क्रिस्टल प्राप्त करने के लिए एक उपयुक्त मॉडल प्रणाली के रूप में कार्य करता है, विशेष रूप से झिल्ली प्रोटीन की उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना निर्धारित करने के लिए। इन सिंथेटिक माइक्रोएन्वायरमेंट के माध्यम से, झिल्ली प्रोटीन अपने मूल रचना और कार्यक्षमता को संरक्षित करते हैं, जिससे त्रि-आयामी क्रिस्टल के गठन की सुविधा मिलती है। इस दृष्टिकोण में, डिटर्जेंट-घुलनशील हेटेरोडिमेरिक ABCG5/G8 को कोलेस्ट्रॉल के साथ पूरक DMPC/CHAPSO बाइसेल में पुन: एकीकृत किया गया था। इस सेटअप प्रोटीन क्रिस्टलीकरण के लिए वाष्प प्रसार प्रयोगात्मक प्रक्रिया में कार्यरत किया गया था.
एटीपी-बाइंडिंग कैसेट (एबीसी) ट्रांसपोर्टर्स जैविक झिल्ली 1,2,3,4,5 में विविध एटीपी-निर्भर परिवहन प्रक्रियाओं के लिए जिम्मेदार झिल्ली प्रोटीन का एक सुपरफैमिली बनाते हैं। ये ट्रांसपोर्टर प्रोटीन हृदय रोगों में फंसाए जाते हैं और यकृत में बाद के उत्सर्जन के लिए पित्त को कोलेस्ट्रॉल के प्रवाह को सुविधाजनक बनाने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। नतीजतन, कोलेस्ट्रॉल चयापचय और संतुलनने पिछले कुछ वर्षों में काफी रुचि पैदा की है। शरीर से कोलेस्ट्रॉल और अन्य स्टेरोल के उन्मूलन में शामिल एक विशिष्ट तंत्र में मानव एबीसीजी उपपरिवार के सदस्य शामिल हैं, विशेष रूप से हेटेरोडिमेरिक एबीसीजी 5 / इन जीनों में से किसी एक में उत्परिवर्तन हेटेरोडिमर को बाधित करते हैं, जिससे कार्य का नुकसान होता है और साइटोस्टेरोलेमिया होता है, जो स्टेरोल तस्करी11,12,13 को प्रभावित करने वाला विकार है। रोग की प्रासंगिकता और कोलेस्ट्रॉल के प्रवाह को बढ़ावा देने में उनकी भूमिका को देखते हुए, स्टेरोल ट्रांसपोर्टरों ने महत्वपूर्ण ध्यान आकर्षित किया है। फिर भी, उनके आणविक तंत्र और सब्सट्रेट चयनात्मकता का जटिल विवरण काफी हद तक अज्ञात रहता है। इस प्रकार, ABCG5/G8 की क्रिस्टल संरचना की व्याख्या कोलेस्ट्रॉल परिवहन में तंत्र और डाउनस्ट्रीम कार्यों को समझने की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम है।
झिल्ली प्रोटीन को मोड़ने और सही ढंग से काम करने के लिए झिल्ली के भीतर लंगर डालने की आवश्यकता होती है। नतीजतन, उनके प्राकृतिक वातावरण से झिल्ली प्रोटीन निकालने अक्सर प्रोटीन अस्थिरता, misfolding, और समारोह14,15 के नुकसान में परिणाम. ये चुनौतियां झिल्ली प्रोटीन क्रिस्टलीकरण में आने वाली प्राथमिक बाधाओं को रेखांकित करती हैं। हालांकि, सिंथेटिक डिटर्जेंट बाइलेयर में प्रोटीन का पुनर्गठन, जैसे बाइसेल, इस दुर्दशा के समाधान के रूप में उभरा है, जिससे एक देशी जैसे बाइलेयर मील16 के भीतर झिल्ली प्रोटीन के रखरखाव को सक्षम किया जा सकता है। बाइसेल सिंथेटिक फॉस्फोलिपिड्स और डिटर्जेंट की असेंबली हैं जो पानी में निलंबित और घुलनशील हैं। विशेष रूप से, वे एक बाइलेयर संरचना को अपनाते हैं जो जैविक झिल्ली16,17,18की नकल करता है। तापमान और चिपचिपाहट के आधार पर बाइसेल तरल और जेल चरणों के बीच संक्रमण कर सकते हैं। बाइसेल क्रिस्टलीकरण छोटे बाइलेयर डिस्क और कम तापमान पर कम चिपचिपाहट को भुनाता है, जिससे प्रोटीन और बाइसेल समाधानों के पूरी तरह से मिश्रण की सुविधा मिलती है। बाइसेल का आकार19,20 की तैयारी के दौरान डिटर्जेंट-टू-लिपिड अनुपात पर निर्भर करता है। बाइसेल गठन के लिए प्रचलित डिटर्जेंट में 3- [(3-कोलामिडोप्रोपाइल) डाइमिथाइलमोनियो] -2-हाइड्रॉक्सी-1-प्रोपेनसल्फोनेट (चैप्सो) शामिल हैं, साथ ही 3- [(3-कोलामिडोप्रोपाइल) डाइमिथाइलमोनियो] -1-प्रोपेनसल्फोनेट (सीएचएपीएस) और 1,2-डिट्रिडेकोयल-एसएन-ग्लिसरॉल-3-फॉस्फोकोलिन (डीएचपीसी)21। इन डिटर्जेंट का उपयोग लिपिड जैसे कि di-myristoyl-phosphatidylcholine (DMPC) और 1-palmitoyl-2-oleoyl-phosphatidylcholine (POPC) के संयोजन में किया जाता है। इसके अलावा, हाल के अध्ययनों ने शारीरिक स्थितियों के तहत बाइसेल के भीतर झिल्ली प्रोटीन की पूर्ण कार्यक्षमता का प्रदर्शन किया है। उदाहरण के लिए, ली और सहयोगियों ने लिपिड बाइलेयर22,23 के आधार पर ABCG5/ABCG8 की क्रिस्टल संरचना को सफलतापूर्वक क्रिस्टलीकृत और रिपोर्ट किया। क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया में, प्रोटीन-बाइसेल मिश्रण को मानक उपकरणों का उपयोग करके समायोजित किया जा सकता है, जिसमें उच्च-थ्रूपुट क्रिस्टलीकरण रोबोट24 शामिल हैं। बाइसेल का उपयोग करने की व्यवहार्यता, हालांकि, उच्च तापमान पर क्रिस्टलीकरण की स्थिति के कारण प्रोटीन की थर्मोस्टेबिलिटी पर टिका है। फिर भी, जब अन्य तकनीकों की तुलना में, झिल्ली प्रोटीन के लिए अपेक्षित क्रिस्टलीकरण की स्थिति आम तौर पर हल्की रहती है, जिसमें अवक्षेप, नमक और बफर की कम सांद्रता शामिल होती है। यह झिल्ली प्रोटीन के संरचनात्मक अध्ययन के लिए प्रोटीन-बाइसेल मिश्रण और वाष्प प्रसार दोनों को प्रभावी और आसानी से लागू करने योग्य उपकरण प्रदान करता है।
यह प्रोटोकॉल उच्च रिज़ॉल्यूशन(चित्रा 1)पर ABCG5/G8 की एक्स-रे क्रिस्टल संरचना का निर्धारण करने के लिए प्रोटीन तैयारी और बाइसेल क्रिस्टलीकरण में आवश्यक चरणों की रूपरेखा तैयार करता है।
क्रिस्टलीकरण झिल्ली प्रोटीन से जुड़ी चुनौतियों ने लिपिड-बाइलेयर-संचालित क्रिस्टलीकरण विधियों के विकास को प्रेरित किया है, जैसे कि बाइसेल27 या लिपिड क्यूबिक चरण (एलसीपी)14 दृष्टिकोण। हालांकि, झिल्ली प्रोटीन के सफल क्रिस्टलीकरण को प्राप्त करना अभी भी प्रोटीन की तैयारी के महत्वपूर्ण और कभी-कभी अड़चन वाले कदम पर टिका है। विशेष रूप से, एबीसी ट्रांसपोर्टर एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी के लिए उपयुक्त बढ़ते क्रिस्टल में एक दुर्जेय बाधा पेश करते हैं। यह प्रोटोकॉल मानव ABCG5/G8 स्टेरोल ट्रांसपोर्टर की तैयारी को सुव्यवस्थित करने और बाइसेल क्रिस्टलीकरण दृष्टिकोण के माध्यम से क्रिस्टल विकास को बढ़ावा देने के लिए व्यापक हाथों पर मार्गदर्शन प्रदान करता है।
इस प्रोटोकॉल को तैयार करने में एक महत्वपूर्ण विचार प्रोटीन शुद्धि के प्रारंभिक चरणों में पर्याप्त प्रोटीन उपज के लिए अनिवार्य था, जो पूर्व-क्रिस्टलीकरण उपचार(चित्रा 3)के दौरान प्रोटीन हानि की एक निश्चित डिग्री की अनुमति देता है। इस चुनौती को संबोधित करने के लिए सामान्य रणनीतियों में व्यापक प्रोटीन इंजीनियरिंग, विविध अभिव्यक्ति मेजबानों का उपयोग, और अन्य दृष्टिकोणों के बीच ऑर्थोलॉग या होमोलॉग की खोज शामिल है। फिर भी, इस प्रतीत होता है जटिल प्रक्रिया के साथ, महत्वपूर्ण कदम है कि प्रोटोकॉल की सफलता को कम और भी संभावित सीमाओं है कि जब अन्य एबीसी ट्रांसपोर्टरों या सामान्य में झिल्ली प्रोटीन का अध्ययन कर उत्पन्न हो सकता है में अंतर्दृष्टि प्रदान की पहचान की गई है.
सबसे पहले, इस प्रोटोकॉल प्रोटीन एकत्रीकरण को कम करने के लिए प्रत्येक कदम पर पूरी तरह से centrifugation रोजगार. इसके अतिरिक्त, शुद्ध प्रोटीन की थर्मोस्टेबिलिटी की निरंतर निगरानी महत्वपूर्ण है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग प्रोटीन मोनोडिस्पर्सिटी को सत्यापित करने के लिए किया जाता है, जबकि विश्लेषणात्मक जेल निस्पंदन समय के साथ प्रोटीन स्थिरता को ट्रैक करता है (चित्र 2)। परिपत्र डाइक्रोइज्म (सीडी) या अंतर स्कैनिंग कैलोरीमेट्री (डीएससी) जैसी वैकल्पिक तकनीकों को भी शामिल किया जा सकता है। इसके अलावा, विशिष्ट चरणों में लिपिड का समावेश शुद्ध ABCG5/G8 की गतिविधि और क्रिस्टलोजेनेसिस दोनों को अधिकतम करने के लिए आवश्यक है। उदाहरण के लिए, औसत दर्जे का एटीपी हाइड्रोलिसिस प्रदर्शित करने के लिए कोलेट और सीएचएस आवश्यक हैं; फॉस्फोलिपिड्स मिथाइलेटेड प्रोटीन की स्थिरता बनाए रखने के लिए अपरिहार्य हैं; और कोलेस्ट्रॉल बाइसेल समाधान का एक आवश्यक घटक है, जो उच्च-रिज़ॉल्यूशन एक्स-रे विवर्तन(चित्रा 4)के लिए उपयुक्त क्रिस्टल विकास को बढ़ावा देता है।
संक्षेप में, पूरी प्रक्रिया को एक सप्ताह के प्रयास के भीतर पूरा किया जा सकता है। एलसीपी के विपरीत, हैंगिंग-ड्रॉप क्रिस्टलीकरण ट्रे से क्रिस्टल की पुनर्प्राप्ति सीधी है। आगे देख रहे हैं, एक पर्याप्त प्रोटीन उपज (लगभग 10 मिलीग्राम) के साथ, इस प्रोटोकॉल ABCG5/G8 म्यूटेंट या अन्य ट्रांसपोर्टर प्रोटीन शामिल क्रिस्टलोग्राफिक जांच के विकास के लिए आसानी से अनुकूलनीय है. यह उन मामलों के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक है जो वर्तमान में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के माध्यम से विज़ुअलाइज़ेशन से बचते हैं।
The authors have nothing to disclose.
यह काम एक प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद डिस्कवरी ग्रांट (RGPIN 2018-04070) और JYL को एक कनाडाई स्वास्थ्य अनुसंधान परियोजना अनुदान (PJT-180640) द्वारा समर्थित है। यह प्रोटोकॉल ABCG5/G8 क्रिस्टल संरचनाओं में मूल रिपोर्टों पर आधारित है, जो पहले फरहत एट अल.22 और ली एट अल.23 द्वारा रिपोर्ट की गई थीं।
(NH4)2SO4 | MilliporeSigma | A4915 | |
ABCG5 | National Institute of Health collection | NCBI accession number NM_022436 | |
ABCG8 | National Institute of Health collection | NCBI accession number NM_022437 | |
ÄKTA FPLC system | Cytiva (formerly GE Healthcare Life Sciences) | ||
CaCl2 | Wisent | 600-024-CG | Anhydrous |
CBP | Agilent | 214303 | Calmodulin binding peptide affinity resin |
Centrifugal concentrators (Vivaspin) | Sartorius | ||
CHAPSO | Anatrace | C317 | Anagrade |
Cholesterol | Anatrace | CH200 | |
CHS | Steraloids | C6823-000 | |
DMAB | MilliporeSigma | 180238 | 97% |
DMNG | Anatrace | NG322 | |
DMPC | Anatrace | D514 | |
DOPC | Avanti | 850375 | |
DOPC | Anatrace | D518 | |
DOPE | Avanti | 850725 | |
DTT | Fisher | BP172 | |
Dual Thickness MicroLoops | MiTeGen | ||
EDTA | BioShop | EDT003 | Disodium salt, dihydrate |
EGTA | MilliporeSigma | 324626 | |
Emulsifier (EmulsiFex-C3) | Avestin | ||
Endo H | New England Biolabs | P0702 | |
Ethanol | Greenfield | P016EAAN | Ethyl Alcohol Anhydrous |
Formaldehyde | MilliporeSigma | 252549 | ACS Reagent |
Glycerol | BioShop | GLY004 | |
HEPES | BioShop | HEP001 | |
HRV-3C protease | Homemade | ||
Imidazole | BioShop | IMD510 | Reagent grade |
Iodoacetamide | MilliporeSigma | I1149 | BioUltra |
Isopropanol | Fisher | BP2618212 | |
Leupeptin | BioShop | LEU001 | |
MES | MilliporeSigma | 69892 | BioUltra |
Methanol | Fisher | A412P | |
MgCl2 | Wisent | 800-070-CG | Hydrated |
microfluidizer (LM 20) | Microfluidics | ||
NaCl | BioShop | SOD002 | |
NH4OH | Fisher | A669-212 | ACS Reagent |
Ni-NTA superflow | Qiagen | 30430 | Nickel-charged resins |
PEG 400 | MilliporeSigma | 202398 | |
Pepstatin | BioShop | PEP605 | |
PMSF | MilliporeSigma | P7626 | |
pSGP18 and pLIC | Homemade (derived from pPICZ, Invitrogen) | ||
SDS | BioShop | SDS003 | |
Sodium cholate | Fisher | 229101 | |
Sodium malonate | MilliporeSigma | 63409 | |
Sucrose | Wisent | 800-081-WG | Ultra pure |
Superdex 200 30/100 GL | Cytiva (formerly GE Healthcare Life Sciences) | 28990944 | Prepacked gel-filtration column |
TCEP | |||
TEM | FEI, Technai | ||
Tris Base | Fisher | BP152 | |
β-DDM | Anatrace | D310S | Sol Grade |
β-mercaptoethanol | MilliporeSigma | ||
ε-aminocaproic acid | Fisher | AAA1471936 |