التشريح المجهري وتلطيخ التألق المناعي لأكمام عضلة القلب في الأوردة الرئوية للفئران
Summary
يوضح هذا البروتوكول العزل الموجه بالفحص المجهري وتلطيخ الأوردة الرئوية للفئران. نقوم بإعداد عينات الأنسجة التي تحتوي على الأذين الأيسر والأوردة الرئوية والرئتين المقابلة وتلطيخها لقلب Troponin T و Connexin 43.
Abstract
الأوردة الرئوية (PVs) هي المصدر الرئيسي للضربات خارج الرحم في عدم انتظام ضربات القلب الأذيني وتلعب دورا حاسما في تطور وتطور الرجفان الأذيني (AF). تحتوي PVs على أكمام عضلة القلب (MS) المكونة من خلايا عضلة القلب. يتورط مرض التصلب العصبي المتعدد في بدء وصيانة الرجفان الأذيني ، حيث يحافظ على أوجه التشابه مع عضلة القلب العاملة في القلب ، بما في ذلك القدرة على توليد نبضات كهربائية خارج الرحم. تستخدم القوارض على نطاق واسع وقد تمثل نماذج حيوانية ممتازة لدراسة عضلة القلب الوريدية الرئوية لأن خلايا عضلة القلب موجودة على نطاق واسع في جميع أنحاء جدار الوعاء الدموي. ومع ذلك ، فإن التشريح الدقيق وإعداد PVs الفئران يمثل تحديا بسبب صغر حجم العضو والتشريح المعقد.
نعرض بروتوكول تشريح مجهري موجه بالمجهر لعزل الأذين الأيسر للفأر (LA) مع PVs. يتم إجراء تلطيخ التألق المناعي باستخدام الأجسام المضادة Troponin-T القلبية (cTNT) و connexin 43 (Cx43) لتصور LA و PVs بالطول الكامل. يوفر التصوير عند التكبير 10x و 40x رؤية شاملة للهيكل الكهروضوئي بالإضافة إلى رؤى مفصلة حول بنية عضلة القلب ، ولا سيما تسليط الضوء على وجود connexin 43 داخل MS.
Introduction
الرجفان الأذيني (AF) هو عدم انتظام ضربات القلب المستمر الأكثر شيوعا1. يتزايد انتشار الرجفان الأذيني بشكل أكبر مع عدد متوقع من ~ 17.9 مليون مريض في أوروبا في عام 20601. الرجفان الأذيني مهم للغاية سريريا لأنه عامل خطر أساسي لتطور احتشاء عضلة القلب أو قصور القلب أو السكتة الدماغية ، مما يؤدي إلى عبء فردي واجتماعي واجتماعي واقتصادي هائل1. على الرغم من أن الرجفان الأذيني معروف منذ عقود ، إلا أن الفيزيولوجيا المرضية للرجفان الأذيني لا تزال غير مفهومة تماما2.
بالفعل في أواخر تسعينيات القرن العشرين ، أظهرت الدراسات التأثير الكبير للأوردة الرئوية (PVs) في بدء والحفاظ على AF ، لأنها المصدر الرئيسي للضربات خارج الرحم التي تحفزAF 3. وقد ثبت أن PVs تختلف هيكليا عن الأوعية الدموية الأخرى. بينما تحتوي الأوعية الدموية النموذجية على خلايا عضلية ملساء ، فإن وسائط الغلالة في PVs تحتوي أيضا على خلايا عضلية قلبية4. في القوارض ، توجد هذه العضلات القلبية في كل مكان في جميع أنحاء الخلايا الكهروضوئية بأكملها ، بما في ذلك الأجزاء داخل الرئة وخارجها ، وكذلك منطقة الفتحة5. في البشر ، تحتوي PVs أيضا على خلايا عضلية قلبية ، والتي يمكن ملاحظتها ضمن امتدادات الأذين الأيسر (LA) عضلة القلب ما يسمى بأكمام عضلة القلب (MS)6,7.
مرض التصلب العصبي المتعدد له أوجه تشابه مورفولوجية مع عضلة القلبالأذينية 8. لا يختلف شكل وحجم الخلايا العضلية القلبية الأذينية والكهروضوئية اختلافا كبيرا بين بعضها البعض وتظهر خصائص فسيولوجية كهربية قابلة للمقارنة8. أثبتت التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية داخل الكهروضوئية النشاط الكهربائي لمرض التصلب العصبي المتعدد ، وكشف التصوير الوعائي عن تقلصات متزامنة مع نبضات القلب 9,10.
تقاطعات الفجوة عبارة عن مجمعات بروتينية مكونة للمسام تتكون من ست وحدات فرعية connexin ، والتي تسمح بمرور الأيونات والجزيئات الصغيرة11. توجد تقاطعات الفجوة في المواضع من خلية إلى خلية ، وتربط الخلايا العضلية القلبية المجاورة ، وتمكن من اقتران كهربائي بين الخلايا بين الخلايا العضليةالقلبية 12,13. يتم التعبير عن العديد من أشكال connexin isoforms في القلب مع connexin 43 (Cx43) كونه الشكل المتماثل الأكثر شيوعا الذي يتم التعبير عنه في جميع مناطق القلب14. تقدم الدراسات السابقة دليلا على التعبير عن Cx43 في خلايا عضلة القلب في PVs15,16.
لا يزال من الصعب التحقيق في مرض التصلب العصبي المتعدد داخل الخلايا الكهروضوئية السليمة بسبب بنيتها الدقيقة ، خاصة في النماذج الحيوانية الصغيرة. هنا ، نوضح كيفية تحديد وعزل PVs مع LA وفصوص الرئة في الفئران باستخدام التشريح المجهري الموجه بالمجهر. بالإضافة إلى ذلك ، نظهر تلطيخ التألق المناعي (IF) للخلايا الكهروضوئية لتصور خلايا عضلة القلب وترابطها داخل الخلايا الكهروضوئية.
Protocol
Representative Results
Discussion
باستخدام هذا البروتوكول ، نشارك طريقة لتمييز وعزل PVs لقلب الفأر وإجراء تلطيخ مناعي عليها. بعد حصاد الأعضاء ، تم تجفيف القلب والرئتين في محلول سكروز معقم ، يليه فصل البطينين عن الأذين وفصوص الرئة تحت التوجيه المجهري. بعد ذلك ، تم إعداد قاعدة القلب لتصور الخلايا الكهروضوئية متبوعة بقطعها من …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المركز الألماني لأبحاث القلب والأوعية الدموية (DZHK ؛ 81X3600221to H.V. ، 81X2600255 إلى SC) ، ومجلس المنح الدراسية الصيني (CSC201808130158 إلى R.X.) ، ومؤسسة الأبحاث الألمانية (DFG; برنامج العالم السريري في طب الأوعية الدموية (PRIME) ، MA 2186 / 14-1 إلى P. T.) ، ومؤسسة كورونا (S199 / 10079 / 2019 إلى SC).
Materials
| Adhesion slides | Epredia | 10149870 | |
| AF568-secondary antibody | Invitrogen | A11036 | Host: Goat, Reactivity: Rabbit |
| Agarose | Biozym LE | 840104 | |
| Alexa Fluor 488-secondary antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Host: Goat, Reactivity: Mouse |
| Anti-Connexin 43 /GJA1 antibody | Abcam | ab11370 | Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit |
| Anti-cTNT antibody | Invitrogen | MA5-12960 | Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Brush | Lukas | 5486 | size 6 |
| Cover slips | Epredia | 24 mm x 50 mm | |
| Cryotome Cryo Star NX70 | Epredia | Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C | |
| DFC365FX camera | Leica | ||
| DM6 B fluorescence microscope | Leica | ||
| Dry ice | |||
| Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc. | Gibco | 14040133 | 500 mL |
| Dumont #5FS Forceps | F.S.T. | 91150-20 | 2 pieces needed |
| Fine Scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Fluorescence mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Cell nuclei counterstaining |
| ImageJ | FIJI | analysis and processing software | |
| LAS X | Leica | Imaging software for Leica DM6 B | |
| Microtome blades S35 | Feather | 207500000 | |
| Microwave | |||
| Normal goat serum | Sigma-Aldrich | S26-M | |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Paraformaldehyde 16% | Pierce | 28908 | methanol-free |
| Pasteur pipettes | VWR | 612-1681 | |
| Petri dish | TPP | 93100 | 100 mm diameter |
| Rocker 3D digital | IKA Schüttler | 00040010000 | |
| Slide staining jars | EasyDip | M900-12 | |
| Specimen Molds | Tissue-Tek Cryomold | 4557 | 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| StainTray M920 staining system | StainTray | 631-1923 | Staining system for 20 slides |
| Sterican Needle | Braun | 4657705 | G 27 – used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol |
| Student Vannas Spring Scissors | F.S.T. | 91500-09 | |
| Super PAP Pen Liquid Blocker | Super PAP Pen | N71310-N | |
| Syringes | Braun | 4606108V | 10 mL |
| Tris base | Roche | TRIS-RO | component for 1x Tris-Buffered Saline (TBS) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 |
Riferimenti
- Lippi, G., Sanchis-Gomar, F., Cervellin, G. Global epidemiology of atrial fibrillation: An increasing epidemic and public health challenge. International Journal of Stroke. 16 (2), 217-221 (2021).
- Wijesurendra, R. S., Casadei, B. Mechanisms of atrial fibrillation. Heart. 105 (24), 1860-1867 (2019).
- Haïssaguerre, M., et al. Spontaneous initiation of atrial fibrillation by ectopic beats originating in the pulmonary veins. The New England Journal of Medicine. 339 (10), 659-666 (1998).
- Mueller-Hoecker, J., et al. Of rodents and humans: a light microscopic and ultrastructural study on cardiomyocytes in pulmonary veins. International Journal of Medical Sciences. 5 (3), 152-158 (2008).
- Kramer, A. W., Marks, L. S. The occurrence of cardiac muscle in the pulmonary veins of Rodenita. Journal of Morphology. 117 (2), 135-149 (1965).
- Nathan, H., Eliakim, M. The junction between the left atrium and the pulmonary veins. Circulation. 34 (3), 412-422 (1966).
- Nathan, H., Gloobe, H. Myocardial atrio-venous junctions and extensions (sleeves) over the pulmonary and caval veins: Anatomical observations in various mammals. Thorax. 25 (3), 317-324 (1970).
- Bond, R. C., Choisy, S. C., Bryant, S. M., Hancox, J. C., James, A. F. Ion currents, action potentials, and noradrenergic responses in rat pulmonary vein and left atrial cardiomyocytes. Physiological Reports. 8 (9), 14432 (2020).
- Thiagalingam, A., et al. Pulmonary vein contraction: Characterization of dynamic changes in pulmonary vein morphology using multiphase multislice computed tomography scanning. Heart Rhythm. 5 (12), 1645-1650 (2008).
- Spach, M. S., Barr, R. C., Jewett, P. H. Spread of excitation from the atrium into thoracic veins in human beings and dogs. The American Journal of Cardiology. 30 (8), 844-854 (1972).
- Scott McNutt, N., Weinstein, R. S. Membrane ultrastructure at mammalian intercellular junctions. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 26, 45-101 (1973).
- Barr, L., Dewey, M. M., Berger, W. Propagation of action potentials and the structure of the nexus in cardiac muscle. Journal of General Physiology. 48 (5), 797-823 (1965).
- Kawamura, K., Konishi, T. Ultrastructure of the cell junction of heart muscle with special reference to its functional significance in excitation conduction and to the concept of "disease of intercalated disc". Japanese Circulation Journal. 31 (11), 1533-1543 (1967).
- Van Kempen, M. J., Fromaget, C., Gros, D., Moorman, A. F., Lamers, W. H. Spatial distribution of connexin43, the major cardiac gap junction protein, in the developing and adult rat heart. Circulation Research. 68 (6), 1638-1651 (1991).
- Verheule, S. Tissue structure and connexin expression of canine pulmonary veins. Cardiovascular Research. 55 (4), 727-738 (2002).
- Xiao, Y., et al. Expression of connexin 43, ion channels and Ca2+-handling proteins in rat pulmonary vein cardiomyocytes. Experimental and Therapeutic Medicine. 12 (5), 3233-3241 (2016).
- Xia, R., et al. Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (166), (2020).
- Tomsits, P., et al. Medetomidine/midazolam/fentanyl narcosis alters cardiac autonomic tone leading to conduction disorders and arrhythmias in mice. Lab Animal. 52 (4), 85-92 (2023).
- Xia, R., et al. Isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node. Journal of Visualized Experiments. (171), (2021).
- Bredeloux, P., Pasqualin, C., Bordy, R., Maupoil, V., Findlay, I. Automatic activity arising in cardiac muscle sleeves of the pulmonary vein. Biomolecules. 12 (1), 23 (2021).
- Chen, P. S., et al. The mechanisms of atrial fibrillation. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 17, S2-S7 (2006).
- Thibault, S., Ton, A. -. T., Huynh, F., Fiset, C. Connexin lateralization contributes to male susceptibility to atrial fibrillation. International Journal of Molecular Sciences. 23 (18), 10696 (2022).
