Mikrodissektion und Immunfluoreszenzfärbung von Myokardhülsen in murinen Pulmonalvenen
Summary
Dieses Protokoll demonstriert die mikroskopiegesteuerte Isolierung und Immunfluoreszenzfärbung von murinen Pulmonalvenen. Wir bereiten Gewebeproben vor, die den linken Vorhof, die Lungenvenen und die entsprechende Lunge enthalten, und färben sie für kardiales Troponin T und Connexin 43.
Abstract
Pulmonalvenen (PVs) sind die Hauptursache für ektopische Schläge bei Vorhofrhythmusstörungen und spielen eine entscheidende Rolle bei der Entstehung und dem Fortschreiten von Vorhofflimmern (VHF). PVs enthalten Myokardhülsen (MS), die aus Kardiomyozyten bestehen. MS ist an der Initiierung und Aufrechterhaltung von Vorhofflimmern beteiligt, da sie Ähnlichkeiten mit dem kardialen Arbeitsmyokard bewahrt, einschließlich der Fähigkeit, ektopische elektrische Impulse zu erzeugen. Nagetiere sind weit verbreitet und können hervorragende Tiermodelle für die Untersuchung des Lungenvenenmyokards darstellen, da Kardiomyozyten überall in der Gefäßwand vorhanden sind. Die präzise Mikrodissektion und Präparation von murinen PVs ist jedoch aufgrund der geringen Organgröße und der komplizierten Anatomie eine Herausforderung.
Wir demonstrieren ein mikroskopiegesteuertes Mikrodissektionsprotokoll zur Isolierung des murinen linken Vorhofs (LA) zusammen mit den PVs. Eine Immunfluoreszenzfärbung mit kardialen Troponin-T (cTNT) und Connexin 43 (Cx43) Antikörpern wird durchgeführt, um die LA und PVs in voller Länge sichtbar zu machen. Die Bildgebung mit 10-facher und 40-facher Vergrößerung bietet einen umfassenden Blick auf die PV-Struktur sowie detaillierte Einblicke in die myokardiale Architektur, wobei insbesondere das Vorhandensein von connexin 43 im MS hervorgehoben wird.
Introduction
Vorhofflimmern ist die häufigste anhaltende Herzrhythmusstörung1. Die Prävalenz von Vorhofflimmern nimmt mit einer erwarteten Zahl von ~17,9 Millionen Patienten in Europa im Jahr 2060 noch weiter zu1. Vorhofflimmern ist klinisch von großer Bedeutung, da es ein wesentlicher Risikofaktor für die Entwicklung von Myokardinfarkt, Herzinsuffizienz oder Schlaganfall ist, was zu einer enormen individuellen, sozialen und sozioökonomischen Belastung führt1. Obwohl Vorhofflimmern seit Jahrzehnten bekannt ist, ist die Pathophysiologie von Vorhofflimmern immer noch nicht vollständig verstanden2.
Bereits in den späten 1990er Jahren zeigten Studien den großen Einfluss von Pulmonalvenen (PVs) auf die Initiierung und Aufrechterhaltung von Vorhofflimmern, da sie die Hauptquelle für Vorhofflimmern auslösende ektopische Schläge sind3. Es konnte gezeigt werden, dass sich PVs strukturell von anderen Blutgefäßen unterscheiden. Während typische Blutgefäße glatte Muskelzellen enthalten, enthält die Tunica media von PVs auch Kardiomyozyten4. Bei Nagetieren ist diese Herzmuskulatur ubiquitär in den gesamten PVs, einschließlich der intra- und extrapulmonalen Anteile, sowie der Öffnungsregion5 vorhanden. Beim Menschen enthalten PVs auch Kardiomyozyten, die innerhalb von Ausläufern des linken Vorhofmyokards (LA) beobachtet werden können – sogenannte Myokardhülsen (MS)6,7.
MS weisen morphologische Ähnlichkeiten mit dem Vorhofmyokard8 auf. Die Form und Größe von Vorhof- und PV-Kardiomyozyten unterscheidet sich nicht signifikant untereinander und zeigt vergleichbare elektrophysiologische Eigenschaften8. Elektrophysiologische Aufzeichnungen innerhalb des PV haben die elektrische Aktivität der MS nachgewiesen, und angiographische Bildgebung hat Kontraktionen gezeigt, die mit dem Herzschlag synchronisiertsind 9,10.
Gap Junctions sind porenbildende Proteinkomplexe, die aus sechs Connexin-Untereinheiten bestehen und den Durchgang von Ionen und kleinen Molekülen ermöglichen11. In den Zell-zu-Zell-Appositionen existieren Gap Junctions, die benachbarte Kardiomyozyten miteinander verbinden und eine interzelluläre elektrische Kopplung zwischen Kardiomyozytenermöglichen 12,13. Im Herzen werden mehrere Connexin-Isoformen exprimiert, wobei Connexin 43 (Cx43) die häufigste Isoform ist, die in allen Regionen des Herzens exprimiertwird 14. Frühere Studien liefern Hinweise auf die Expression von Cx43 in Kardiomyozyten der PVs15,16.
Die Untersuchung von MS in intakten PVs ist aufgrund ihrer empfindlichen Struktur, insbesondere in Kleintiermodellen, nach wie vor eine Herausforderung. In dieser Arbeit zeigen wir, wie PVs zusammen mit LA und Lungenlappen in Mäusen mittels mikroskopiegesteuerter Mikrodissektion identifiziert und isoliert werden können. Darüber hinaus demonstrieren wir die Immunfluoreszenzfärbung (IF) von PVs, um Kardiomyozyten und ihre Verbindungen innerhalb der PVs sichtbar zu machen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mit diesem Protokoll teilen wir eine Methode zur Unterscheidung und Isolierung der PVs des Mausherzens und führen eine Immunfluoreszenzfärbung durch. Nach der Organentnahme wurden Herz und Lunge in sterilisierter Saccharoselösung dehydriert, gefolgt von der Trennung der Ventrikel vom Vorhof und den Lungenlappen unter mikroskopischer Kontrolle. Danach wurde die Herzbasis vorbereitet, um die PVs zu visualisieren und sie anschließend am Hilum aus der Lunge zu schneiden. Die anschließende Immunfluoreszenzfärbung wurde …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Deutsche Zentrum für Herz-Kreislauf-Forschung (DZHK; 81X3600221bis H.V., 81X2600255 bis S.C.), den China Scholarship Council (CSC201808130158 an R.X.), die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; Clinician Scientist Program in Vascular Medicine (PRIME), MA 2186/14-1 bis P. T.) und der Corona Foundation (S199/10079/2019 bis S. C.).
Materials
| Adhesion slides | Epredia | 10149870 | |
| AF568-secondary antibody | Invitrogen | A11036 | Host: Goat, Reactivity: Rabbit |
| Agarose | Biozym LE | 840104 | |
| Alexa Fluor 488-secondary antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Host: Goat, Reactivity: Mouse |
| Anti-Connexin 43 /GJA1 antibody | Abcam | ab11370 | Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit |
| Anti-cTNT antibody | Invitrogen | MA5-12960 | Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Brush | Lukas | 5486 | size 6 |
| Cover slips | Epredia | 24 mm x 50 mm | |
| Cryotome Cryo Star NX70 | Epredia | Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C | |
| DFC365FX camera | Leica | ||
| DM6 B fluorescence microscope | Leica | ||
| Dry ice | |||
| Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc. | Gibco | 14040133 | 500 mL |
| Dumont #5FS Forceps | F.S.T. | 91150-20 | 2 pieces needed |
| Fine Scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Fluorescence mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Cell nuclei counterstaining |
| ImageJ | FIJI | analysis and processing software | |
| LAS X | Leica | Imaging software for Leica DM6 B | |
| Microtome blades S35 | Feather | 207500000 | |
| Microwave | |||
| Normal goat serum | Sigma-Aldrich | S26-M | |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Paraformaldehyde 16% | Pierce | 28908 | methanol-free |
| Pasteur pipettes | VWR | 612-1681 | |
| Petri dish | TPP | 93100 | 100 mm diameter |
| Rocker 3D digital | IKA Schüttler | 00040010000 | |
| Slide staining jars | EasyDip | M900-12 | |
| Specimen Molds | Tissue-Tek Cryomold | 4557 | 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| StainTray M920 staining system | StainTray | 631-1923 | Staining system for 20 slides |
| Sterican Needle | Braun | 4657705 | G 27 – used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol |
| Student Vannas Spring Scissors | F.S.T. | 91500-09 | |
| Super PAP Pen Liquid Blocker | Super PAP Pen | N71310-N | |
| Syringes | Braun | 4606108V | 10 mL |
| Tris base | Roche | TRIS-RO | component for 1x Tris-Buffered Saline (TBS) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 |
Riferimenti
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