מיקרודיסקציה וצביעה אימונופלואורסצנטית של שרוולי שריר הלב בוורידי ריאה מורין
Summary
פרוטוקול זה מדגים בידוד מונחה מיקרוסקופיה וצביעה אימונופלואורסצנטית של ורידים ריאתיים מורינים. אנו מכינים דגימות רקמה המכילות את אטריום שמאל, ורידים ריאתיים, ואת הריאות המתאימות ומכתימים אותם עבור טרופונין T לב ו Connexin 43.
Abstract
ורידים ריאתיים (PVs) הם המקור העיקרי לפעימות חוץ רחמיות בהפרעות קצב פרוזדוריות וממלאים תפקיד מכריע בהתפתחות ובהתקדמות של פרפור פרוזדורים (AF). PVs מכילים שרוולי שריר הלב (MS) המורכבים קרדיומיוציטים. טרשת נפוצה מעורבת בהפעלה ובתחזוקה של מיקוד אוטומטי, מכיוון שהיא שומרת על דמיון לשריר הלב הפועל בלב, כולל היכולת לייצר דחפים חשמליים חוץ רחמיים. מכרסמים נמצאים בשימוש נרחב ועשויים לייצג מודלים מצוינים של בעלי חיים לחקר שריר הלב של ורידים ריאתיים, שכן קרדיומיוציטים נמצאים באופן נרחב בכל דופן כלי הדם. עם זאת, מיקרודיסקציה מדויקת והכנה של PVs מורין מאתגרת בשל גודל האיבר הקטן והאנטומיה המורכבת.
אנו מדגימים פרוטוקול מיקרודיסקציה מונחה מיקרוסקופיה לבידוד האטריום השמאלי של מורין (LA) יחד עם PVs. צביעה אימונופלואורסצנטית באמצעות נוגדנים Troponin-T (cTNT) ו- connexin 43 (Cx43) מבוצעת כדי להמחיש את LA ו- PVs באורך מלא. הדמיה בהגדלה של 10x ו- 40x מספקת תצוגה מקיפה של מבנה PV, כמו גם תובנות מפורטות על ארכיטקטורת שריר הלב, במיוחד הדגשת נוכחותו של קונקסין 43 בתוך הטרשת הנפוצה.
Introduction
פרפור פרוזדורים (AF) הוא הפרעת הקצב המתמשכת הנפוצה ביותר1. השכיחות של AF עולה עוד יותר עם מספר צפוי של ~ 17.9 מיליון חולים באירופה בשנת 20601. AF חשוב מאוד מבחינה קלינית מכיוון שהוא גורם סיכון חיוני להתפתחות אוטם שריר הלב, אי ספיקת לב או שבץ, וכתוצאה מכך נטל אישי, חברתי וסוציו-אקונומי עצום. למרות שמיקוד אוטומטי ידוע כבר עשרות שנים, הפתופיזיולוגיה של AF עדיין לא מובנת במלואה2.
כבר בסוף שנות התשעים, מחקרים הדגימו את ההשפעה הגדולה של ורידים ריאתיים (PVs) בייזום ושמירה על AF, שכן הם המקור העיקרי לפעימות חוץ רחמיותהמפעילות AF 3. הוכח כי PVs שונים מבחינה מבנית מכלי דם אחרים. בעוד כלי דם טיפוסיים מכילים תאי שריר חלקים, מדיה טוניקה של PVs מכיל גם cardiomyocytes4. במכרסמים, שריר לב זה נמצא בכל מקום בכל PVs, כולל חלקים תוך ריאתיים וחוץ-ריאתיים, כמו גם באזור הפתח5. בבני אדם, PVs מכילים גם קרדיומיוציטים, אשר ניתן לראות בתוך שלוחות של שריר הלב השמאלי פרוזדורים (LA) – מה שנקרא שרוולי שריר הלב (MS)6,7.
לטרשת נפוצה יש דמיון מורפולוגי לשריר הלב הפרוזדורי8. הצורה והגודל של קרדיומיוציטים פרוזדורים ו- PV אינם משתנים באופן משמעותי זה מזה ומראים תכונות אלקטרופיזיולוגיות דומות8. רישומים אלקטרופיזיולוגיים בתוך PV הוכיחו את הפעילות החשמלית של טרשת נפוצה, והדמיה אנגיוגרפית חשפה התכווצויות המסונכרנות עם פעימות הלב 9,10.
צמתי פער הם קומפלקסים חלבוניים יוצרי נקבוביות המורכבים משש תת-יחידות קונקסין, המאפשרות מעבר של יונים ומולקולות קטנות11. צמתי מרווחים קיימים באפפוזיציות בין תאים, מחברים קרדיומיוציטים שכנים, ומאפשרים צימוד חשמלי בין-תאי בין קרדיומיוציטים12,13. מספר איזופורמים של קונקסין מבוטאים בלב, כאשר קונקסין 43 (Cx43) הוא האיזופורם הנפוץ ביותר המתבטא בכל אזורי הלב14. מחקרים קודמים מספקים ראיות לביטוי של Cx43 בקרדיומיוציטים של PVs15,16.
זה עדיין מאתגר לחקור טרשת נפוצה בתוך PVs שלמים בשל המבנה העדין שלהם, במיוחד במודלים של בעלי חיים קטנים. במאמר זה אנו מדגימים כיצד לזהות ולבודד PVs יחד עם LA ואונות ריאה בעכברים באמצעות מיקרודיסקציה מונחית מיקרוסקופיה. בנוסף, אנו מדגימים צביעה אימונופלואורסצנטית (IF) של PVs כדי להמחיש קרדיומיוציטים והחיבורים שלהם בתוך PVs.
Protocol
Representative Results
Discussion
עם פרוטוקול זה, אנו חולקים שיטה להבחין ולבודד את PVs של לב העכבר ולבצע צביעה immunofluorescence עליהם. לאחר קצירת האיברים, הלב והריאות התייבשו בתמיסת סוכרוז מעוקרת, ולאחר מכן הפרדת החדרים מהאטריום ואונות הריאה בהנחיה מיקרוסקופית. לאחר מכן, בסיס הלב היה מוכן לדמיין את PVs ואחריו לחתוך אותם מן הריאות בה?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המרכז הגרמני לחקר הלב וכלי הדם (DZHK; 81X3600221to H.V., 81X2600255 ל- S.C.), מועצת המלגות של סין (CSC201808130158 ל- R.X.), קרן המחקר הגרמנית (DFG; תכנית מדען קליני ברפואת כלי דם (PRIME), MA 2186/14-1 עד P. T.), וקרן הקורונה (S199/10079/2019 ל- S. C).
Materials
| Adhesion slides | Epredia | 10149870 | |
| AF568-secondary antibody | Invitrogen | A11036 | Host: Goat, Reactivity: Rabbit |
| Agarose | Biozym LE | 840104 | |
| Alexa Fluor 488-secondary antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Host: Goat, Reactivity: Mouse |
| Anti-Connexin 43 /GJA1 antibody | Abcam | ab11370 | Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit |
| Anti-cTNT antibody | Invitrogen | MA5-12960 | Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Brush | Lukas | 5486 | size 6 |
| Cover slips | Epredia | 24 mm x 50 mm | |
| Cryotome Cryo Star NX70 | Epredia | Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C | |
| DFC365FX camera | Leica | ||
| DM6 B fluorescence microscope | Leica | ||
| Dry ice | |||
| Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc. | Gibco | 14040133 | 500 mL |
| Dumont #5FS Forceps | F.S.T. | 91150-20 | 2 pieces needed |
| Fine Scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Fluorescence mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Cell nuclei counterstaining |
| ImageJ | FIJI | analysis and processing software | |
| LAS X | Leica | Imaging software for Leica DM6 B | |
| Microtome blades S35 | Feather | 207500000 | |
| Microwave | |||
| Normal goat serum | Sigma-Aldrich | S26-M | |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Paraformaldehyde 16% | Pierce | 28908 | methanol-free |
| Pasteur pipettes | VWR | 612-1681 | |
| Petri dish | TPP | 93100 | 100 mm diameter |
| Rocker 3D digital | IKA Schüttler | 00040010000 | |
| Slide staining jars | EasyDip | M900-12 | |
| Specimen Molds | Tissue-Tek Cryomold | 4557 | 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| StainTray M920 staining system | StainTray | 631-1923 | Staining system for 20 slides |
| Sterican Needle | Braun | 4657705 | G 27 – used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol |
| Student Vannas Spring Scissors | F.S.T. | 91500-09 | |
| Super PAP Pen Liquid Blocker | Super PAP Pen | N71310-N | |
| Syringes | Braun | 4606108V | 10 mL |
| Tris base | Roche | TRIS-RO | component for 1x Tris-Buffered Saline (TBS) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 |
Riferimenti
- Lippi, G., Sanchis-Gomar, F., Cervellin, G. Global epidemiology of atrial fibrillation: An increasing epidemic and public health challenge. International Journal of Stroke. 16 (2), 217-221 (2021).
- Wijesurendra, R. S., Casadei, B. Mechanisms of atrial fibrillation. Heart. 105 (24), 1860-1867 (2019).
- Haïssaguerre, M., et al. Spontaneous initiation of atrial fibrillation by ectopic beats originating in the pulmonary veins. The New England Journal of Medicine. 339 (10), 659-666 (1998).
- Mueller-Hoecker, J., et al. Of rodents and humans: a light microscopic and ultrastructural study on cardiomyocytes in pulmonary veins. International Journal of Medical Sciences. 5 (3), 152-158 (2008).
- Kramer, A. W., Marks, L. S. The occurrence of cardiac muscle in the pulmonary veins of Rodenita. Journal of Morphology. 117 (2), 135-149 (1965).
- Nathan, H., Eliakim, M. The junction between the left atrium and the pulmonary veins. Circulation. 34 (3), 412-422 (1966).
- Nathan, H., Gloobe, H. Myocardial atrio-venous junctions and extensions (sleeves) over the pulmonary and caval veins: Anatomical observations in various mammals. Thorax. 25 (3), 317-324 (1970).
- Bond, R. C., Choisy, S. C., Bryant, S. M., Hancox, J. C., James, A. F. Ion currents, action potentials, and noradrenergic responses in rat pulmonary vein and left atrial cardiomyocytes. Physiological Reports. 8 (9), 14432 (2020).
- Thiagalingam, A., et al. Pulmonary vein contraction: Characterization of dynamic changes in pulmonary vein morphology using multiphase multislice computed tomography scanning. Heart Rhythm. 5 (12), 1645-1650 (2008).
- Spach, M. S., Barr, R. C., Jewett, P. H. Spread of excitation from the atrium into thoracic veins in human beings and dogs. The American Journal of Cardiology. 30 (8), 844-854 (1972).
- Scott McNutt, N., Weinstein, R. S. Membrane ultrastructure at mammalian intercellular junctions. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 26, 45-101 (1973).
- Barr, L., Dewey, M. M., Berger, W. Propagation of action potentials and the structure of the nexus in cardiac muscle. Journal of General Physiology. 48 (5), 797-823 (1965).
- Kawamura, K., Konishi, T. Ultrastructure of the cell junction of heart muscle with special reference to its functional significance in excitation conduction and to the concept of "disease of intercalated disc". Japanese Circulation Journal. 31 (11), 1533-1543 (1967).
- Van Kempen, M. J., Fromaget, C., Gros, D., Moorman, A. F., Lamers, W. H. Spatial distribution of connexin43, the major cardiac gap junction protein, in the developing and adult rat heart. Circulation Research. 68 (6), 1638-1651 (1991).
- Verheule, S. Tissue structure and connexin expression of canine pulmonary veins. Cardiovascular Research. 55 (4), 727-738 (2002).
- Xiao, Y., et al. Expression of connexin 43, ion channels and Ca2+-handling proteins in rat pulmonary vein cardiomyocytes. Experimental and Therapeutic Medicine. 12 (5), 3233-3241 (2016).
- Xia, R., et al. Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (166), (2020).
- Tomsits, P., et al. Medetomidine/midazolam/fentanyl narcosis alters cardiac autonomic tone leading to conduction disorders and arrhythmias in mice. Lab Animal. 52 (4), 85-92 (2023).
- Xia, R., et al. Isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node. Journal of Visualized Experiments. (171), (2021).
- Bredeloux, P., Pasqualin, C., Bordy, R., Maupoil, V., Findlay, I. Automatic activity arising in cardiac muscle sleeves of the pulmonary vein. Biomolecules. 12 (1), 23 (2021).
- Chen, P. S., et al. The mechanisms of atrial fibrillation. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 17, S2-S7 (2006).
- Thibault, S., Ton, A. -. T., Huynh, F., Fiset, C. Connexin lateralization contributes to male susceptibility to atrial fibrillation. International Journal of Molecular Sciences. 23 (18), 10696 (2022).
