Microdissezione e colorazione in immunofluorescenza di manicotti miocardici nelle vene polmonari murine
Summary
Questo protocollo dimostra l’isolamento guidato dalla microscopia e la colorazione in immunofluorescenza delle vene polmonari murine. Prepariamo campioni di tessuto contenenti l’atrio sinistro, le vene polmonari e i polmoni corrispondenti e li coloriamo per la troponina T cardiaca e la connessina 43.
Abstract
Le vene polmonari (PV) sono la principale fonte di battiti ectopici nelle aritmie atriali e svolgono un ruolo cruciale nello sviluppo e nella progressione della fibrillazione atriale (FA). I PV contengono manicotti miocardici (SM) composti da cardiomiociti. Le sclerosi multipla sono implicate nell’inizio e nel mantenimento della fibrillazione atriale, in quanto conservano somiglianze con il miocardio cardiaco, inclusa la capacità di generare impulsi elettrici ectopici. I roditori sono ampiamente utilizzati e possono rappresentare ottimi modelli animali per studiare il miocardio della vena polmonare poiché i cardiomiociti sono ampiamente presenti in tutta la parete del vaso. Tuttavia, la microdissezione precisa e la preparazione di PV murini sono impegnative a causa delle piccole dimensioni dell’organo e dell’anatomia intricata.
Dimostriamo un protocollo di microdissezione guidato dalla microscopia per isolare l’atrio sinistro murino (LA) insieme ai PV. Viene eseguita una colorazione a immunofluorescenza utilizzando anticorpi cardiaci Troponina-T (cTNT) e connessina 43 (Cx43) per visualizzare LA e PV in tutta la sua lunghezza. L’imaging con ingrandimenti 10x e 40x fornisce una visione completa della struttura del PV e approfondimenti dettagliati sull’architettura miocardica, evidenziando in particolare la presenza della connessina 43 all’interno della SM.
Introduction
La fibrillazione atriale (FA) è l’aritmia sostenuta più comune1. La prevalenza della fibrillazione atriale è in ulteriore aumento, con un numero previsto di ~17,9 milioni di pazienti in Europa nel 20601. La fibrillazione atriale è clinicamente molto importante poiché è un fattore di rischio essenziale per lo sviluppo di infarto miocardico, insufficienza cardiaca o ictus, con conseguente enorme onere individuale, sociale e socioeconomico1. Anche se la fibrillazione atriale è nota da decenni, la fisiopatologia della fibrillazione atriale non è ancora del tutto compresa2.
Già alla fine degli anni ’90, gli studi hanno dimostrato il grande impatto delle vene polmonari (PV) nell’avvio e nel mantenimento della fibrillazione atriale, in quanto sono la principale fonte di battiti ectopici che innescano la fibrillazione atriale3. È stato dimostrato che i PV differiscono strutturalmente dagli altri vasi sanguigni. Mentre i vasi sanguigni tipici contengono cellule muscolari lisce, la tunica media dei PV contiene anche cardiomiociti4. Nei roditori, questa muscolatura cardiaca è presente in modo ubiquitario in tutte le PV, comprese le parti intra ed extrapolmonari, nonché la regione dell’orifizio5. Nell’uomo, i PV contengono anche cardiomiociti, che possono essere osservati all’interno delle estensioni del miocardio dell’atrio sinistro (LA), le cosiddette maniche miocardiche (SM)6,7.
La SM presenta somiglianze morfologiche con il miocardio8 atriale. La forma e le dimensioni dei cardiomiociti atriali e PV non variano significativamente tra loro e mostrano proprietà elettrofisiologiche comparabili8. Le registrazioni elettrofisiologiche all’interno del PV hanno dimostrato l’attività elettrica della SM e l’imaging angiografico ha rivelato contrazioni sincronizzate con il battito cardiaco 9,10.
Le giunzioni gap sono complessi proteici che formano pori composti da sei subunità connessine, che consentono il passaggio di ioni e piccole molecole11. Le giunzioni gap esistono nelle apposizioni cellula-cellula, interconnettono i cardiomiociti vicini e consentono un accoppiamento elettrico intercellulare tra i cardiomiociti 12,13. Diverse isoforme di connessina sono espresse nel cuore, con la connessina 43 (Cx43) che è l’isoforma più comune espressa in tutte le regioni del cuore14. Studi precedenti hanno fornito prove dell’espressione di Cx43 nei cardiomiociti dei PV15,16.
Rimane difficile studiare la SM all’interno di PV intatti a causa della loro struttura delicata, specialmente nei modelli animali di piccola taglia. Qui, dimostriamo come identificare e isolare i PV insieme a LA e ai lobi polmonari nei topi utilizzando la microdissezione guidata dalla microscopia. Inoltre, dimostriamo la colorazione in immunofluorescenza (IF) dei PV per visualizzare i cardiomiociti e le loro interconnessioni all’interno dei PV.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con questo protocollo, condividiamo un metodo per distinguere e isolare i PV del cuore di topo ed eseguire la colorazione in immunofluorescenza su di essi. Dopo il prelievo di organi, il cuore e i polmoni sono stati disidratati in una soluzione di saccarosio sterilizzata, seguita dalla separazione dei ventricoli dall’atrio e dai lobi polmonari sotto guida microscopica. Successivamente, la base del cuore è stata preparata per visualizzare i PV seguiti dal taglio dai polmoni all’ilo. La successiva colorazione a immunofluo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal Centro tedesco per la ricerca cardiovascolare (DZHK; 81X3600221to H.V., 81X2600255 to S.C.), dal China Scholarship Council (CSC201808130158 to R.X.), dalla Fondazione tedesca per la ricerca (DFG; Clinician Scientist Program in Vascular Medicine (PRIME), MA 2186/14-1 a P. T.), e la Fondazione Corona (S199/10079/2019 a S. C.).
Materials
| Adhesion slides | Epredia | 10149870 | |
| AF568-secondary antibody | Invitrogen | A11036 | Host: Goat, Reactivity: Rabbit |
| Agarose | Biozym LE | 840104 | |
| Alexa Fluor 488-secondary antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Host: Goat, Reactivity: Mouse |
| Anti-Connexin 43 /GJA1 antibody | Abcam | ab11370 | Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit |
| Anti-cTNT antibody | Invitrogen | MA5-12960 | Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Brush | Lukas | 5486 | size 6 |
| Cover slips | Epredia | 24 mm x 50 mm | |
| Cryotome Cryo Star NX70 | Epredia | Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C | |
| DFC365FX camera | Leica | ||
| DM6 B fluorescence microscope | Leica | ||
| Dry ice | |||
| Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc. | Gibco | 14040133 | 500 mL |
| Dumont #5FS Forceps | F.S.T. | 91150-20 | 2 pieces needed |
| Fine Scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Fluorescence mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Cell nuclei counterstaining |
| ImageJ | FIJI | analysis and processing software | |
| LAS X | Leica | Imaging software for Leica DM6 B | |
| Microtome blades S35 | Feather | 207500000 | |
| Microwave | |||
| Normal goat serum | Sigma-Aldrich | S26-M | |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Paraformaldehyde 16% | Pierce | 28908 | methanol-free |
| Pasteur pipettes | VWR | 612-1681 | |
| Petri dish | TPP | 93100 | 100 mm diameter |
| Rocker 3D digital | IKA Schüttler | 00040010000 | |
| Slide staining jars | EasyDip | M900-12 | |
| Specimen Molds | Tissue-Tek Cryomold | 4557 | 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| StainTray M920 staining system | StainTray | 631-1923 | Staining system for 20 slides |
| Sterican Needle | Braun | 4657705 | G 27 – used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol |
| Student Vannas Spring Scissors | F.S.T. | 91500-09 | |
| Super PAP Pen Liquid Blocker | Super PAP Pen | N71310-N | |
| Syringes | Braun | 4606108V | 10 mL |
| Tris base | Roche | TRIS-RO | component for 1x Tris-Buffered Saline (TBS) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 |
Riferimenti
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