Murin Pulmoner Venlerde Miyokard Kılıflarının Mikrodiseksiyonu ve İmmünofloresan Boyanması
Summary
Bu protokol, murin pulmoner venlerinin mikroskopi kılavuzluğunda izolasyonunu ve immünofloresan boyamasını gösterir. Sol atriyum, pulmoner venler ve ilgili akciğerleri içeren doku örnekleri hazırlıyoruz ve bunları kardiyak Troponin T ve Connexin 43 için boyuyoruz.
Abstract
Pulmoner venler (PV’ler) atriyal aritmilerde ektopik atımların ana kaynağıdır ve atriyal fibrilasyonun (AF) gelişiminde ve ilerlemesinde çok önemli bir rol oynar. PV’ler, kardiyomiyositlerden oluşan miyokardiyal kılıflar (MS) içerir. MS, ektopik elektriksel uyarılar üretme yeteneği de dahil olmak üzere kardiyak çalışan miyokard ile benzerlikleri korudukları için AF’nin başlatılması ve sürdürülmesinde rol oynar. Kemirgenler yaygın olarak kullanılır ve kardiyomiyositler damar duvarının her yerinde yaygın olarak bulunduğundan, pulmoner ven miyokardını incelemek için mükemmel hayvan modellerini temsil edebilir. Bununla birlikte, küçük organ boyutu ve karmaşık anatomi nedeniyle murin PV’lerinin hassas mikrodiseksiyonu ve hazırlanması zordur.
PV’ler ile birlikte murin sol atriyumunu (LA) izole etmek için mikroskopi kılavuzluğunda bir mikrodiseksiyon protokolü gösterdik. LA ve PV’leri tam uzunlukta görüntülemek için kardiyak Troponin-T (cTNT) ve konneksin 43 (Cx43) antikorları kullanılarak immünofloresan boyama yapılır. 10x ve 40x büyütmede görüntüleme, PV yapısının kapsamlı bir görünümünün yanı sıra miyokard mimarisine ilişkin ayrıntılı bilgiler sağlar, özellikle MS içinde connexin 43’ün varlığını vurgular.
Introduction
Atriyal fibrilasyon (AF) en sık görülen sürekli aritmidir1. AF prevalansı, 2060 yılında Avrupa’da beklenen ~17,9 milyon hasta sayısıyla daha da artmaktadır1. AF, miyokard enfarktüsü, kalp yetmezliği veya inme gelişimi için önemli bir risk faktörü olduğu ve muazzam bir bireysel, sosyal ve sosyoekonomik yüke neden olduğu için klinik olarak oldukça önemlidir1. AF onlarca yıldır bilinmesine rağmen, AF’nin patofizyolojisi hala tam olarak anlaşılamamıştır2.
Zaten 1990’ların sonlarında, çalışmalar pulmoner venlerin (PV’ler) AF’yi başlatmada ve sürdürmede büyük etkisini göstermiştir, çünkü bunlar AF’yi tetikleyen ektopik atımlarınana kaynağıdır 3. PV’lerin yapısal olarak diğer kan damarlarından farklı olduğu gösterilmiştir. Tipik kan damarları düz kas hücreleri içerirken, PV’lerin tunika ortamı da kardiyomiyositleriçerir 4. Kemirgenlerde, bu kardiyak kas sistemi, intra ve ekstrapulmoner kısımların yanı sıra orifis bölgesi5 dahil olmak üzere tüm PV’ler boyunca her yerde bulunur. İnsanlarda, PV’ler ayrıca sol atriyal (LA) miyokard olarak adlandırılan miyokard kılıflarının (MS) uzantılarında gözlenebilen kardiyomiyositler içerir6,7.
MS, atriyal miyokard8 ile morfolojik benzerliklere sahiptir. Atriyal ve PV kardiyomiyositlerin şekli ve boyutu birbirleri arasında önemli ölçüde farklılık göstermez ve karşılaştırılabilir elektrofizyolojik özellikler gösterir8. PV içindeki elektrofizyolojik kayıtlar MS’in elektriksel aktivitesini kanıtlamıştır ve anjiyografik görüntüleme kalp atışıile senkronize kasılmaları ortaya koymuştur 9,10.
Boşluk bağlantıları, iyonların ve küçük moleküllerin geçişine izin veren altı conneksin alt biriminden oluşan gözenek oluşturan protein kompleksleridir11. Hücreden hücreye atamalarda boşluk bağlantıları bulunur, komşu kardiyomiyositleri birbirine bağlar ve kardiyomiyositler12,13 arasında hücreler arası bir elektriksel bağlantı sağlar. Kalpte birkaç konneksin izoformu eksprese edilir, konneksin 43 (Cx43) kalbin tüm bölgelerinde ifade edilen en yaygın izoformdur14. Önceki çalışmalar, PV’lerin15,16 kardiyomiyositlerinde Cx43’ün ekspresyonu için kanıt sağlar.
Özellikle küçük hayvan modellerinde, hassas yapıları nedeniyle bozulmamış PV’lerde MS’i araştırmak zor olmaya devam etmektedir. Burada, mikroskopi kılavuzluğunda mikrodiseksiyon kullanarak farelerde PV’lerin LA ve akciğer lobları ile birlikte nasıl tanımlanacağını ve izole edileceğini gösteriyoruz. Ek olarak, kardiyomiyositleri ve PV’ler içindeki ara bağlantılarını görselleştirmek için PV’lerin immünofloresan (IF) boyamasını gösteriyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolle, fare kalbinin PV’lerini ayırt etmek ve izole etmek ve üzerlerinde immünofloresan boyama yapmak için bir yöntemi paylaşıyoruz. Organ toplandıktan sonra, kalp ve akciğerler sterilize edilmiş sükroz çözeltisinde kurutuldu, ardından ventriküller mikroskobik kılavuzluk altında atriyum ve akciğer loblarından ayrıldı. Daha sonra, kalp tabanı PV’leri görselleştirmek için hazırlandı ve ardından hilustaki akciğerlerden kesildi. Daha sonraki immünofloresan boyama, dokuyu OCT bileşiğine…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Alman Kardiyovasküler Araştırma Merkezi (DZHK; 81X3600221to H.V., 81X2600255 to S.C.), Çin Burs Konseyi (CSC201808130158 to R.X.), Alman Araştırma Vakfı (DFG; Vasküler Tıpta Klinisyen Bilim Adamı Programı (PRIME), MA 2186/14-1 – PT) ve Corona Vakfı (S199/10079/2019 – SC).
Materials
| Adhesion slides | Epredia | 10149870 | |
| AF568-secondary antibody | Invitrogen | A11036 | Host: Goat, Reactivity: Rabbit |
| Agarose | Biozym LE | 840104 | |
| Alexa Fluor 488-secondary antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Host: Goat, Reactivity: Mouse |
| Anti-Connexin 43 /GJA1 antibody | Abcam | ab11370 | Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit |
| Anti-cTNT antibody | Invitrogen | MA5-12960 | Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Brush | Lukas | 5486 | size 6 |
| Cover slips | Epredia | 24 mm x 50 mm | |
| Cryotome Cryo Star NX70 | Epredia | Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C | |
| DFC365FX camera | Leica | ||
| DM6 B fluorescence microscope | Leica | ||
| Dry ice | |||
| Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc. | Gibco | 14040133 | 500 mL |
| Dumont #5FS Forceps | F.S.T. | 91150-20 | 2 pieces needed |
| Fine Scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Fluorescence mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Cell nuclei counterstaining |
| ImageJ | FIJI | analysis and processing software | |
| LAS X | Leica | Imaging software for Leica DM6 B | |
| Microtome blades S35 | Feather | 207500000 | |
| Microwave | |||
| Normal goat serum | Sigma-Aldrich | S26-M | |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Paraformaldehyde 16% | Pierce | 28908 | methanol-free |
| Pasteur pipettes | VWR | 612-1681 | |
| Petri dish | TPP | 93100 | 100 mm diameter |
| Rocker 3D digital | IKA Schüttler | 00040010000 | |
| Slide staining jars | EasyDip | M900-12 | |
| Specimen Molds | Tissue-Tek Cryomold | 4557 | 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| StainTray M920 staining system | StainTray | 631-1923 | Staining system for 20 slides |
| Sterican Needle | Braun | 4657705 | G 27 – used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol |
| Student Vannas Spring Scissors | F.S.T. | 91500-09 | |
| Super PAP Pen Liquid Blocker | Super PAP Pen | N71310-N | |
| Syringes | Braun | 4606108V | 10 mL |
| Tris base | Roche | TRIS-RO | component for 1x Tris-Buffered Saline (TBS) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 |
Riferimenti
- Lippi, G., Sanchis-Gomar, F., Cervellin, G. Global epidemiology of atrial fibrillation: An increasing epidemic and public health challenge. International Journal of Stroke. 16 (2), 217-221 (2021).
- Wijesurendra, R. S., Casadei, B. Mechanisms of atrial fibrillation. Heart. 105 (24), 1860-1867 (2019).
- Haïssaguerre, M., et al. Spontaneous initiation of atrial fibrillation by ectopic beats originating in the pulmonary veins. The New England Journal of Medicine. 339 (10), 659-666 (1998).
- Mueller-Hoecker, J., et al. Of rodents and humans: a light microscopic and ultrastructural study on cardiomyocytes in pulmonary veins. International Journal of Medical Sciences. 5 (3), 152-158 (2008).
- Kramer, A. W., Marks, L. S. The occurrence of cardiac muscle in the pulmonary veins of Rodenita. Journal of Morphology. 117 (2), 135-149 (1965).
- Nathan, H., Eliakim, M. The junction between the left atrium and the pulmonary veins. Circulation. 34 (3), 412-422 (1966).
- Nathan, H., Gloobe, H. Myocardial atrio-venous junctions and extensions (sleeves) over the pulmonary and caval veins: Anatomical observations in various mammals. Thorax. 25 (3), 317-324 (1970).
- Bond, R. C., Choisy, S. C., Bryant, S. M., Hancox, J. C., James, A. F. Ion currents, action potentials, and noradrenergic responses in rat pulmonary vein and left atrial cardiomyocytes. Physiological Reports. 8 (9), 14432 (2020).
- Thiagalingam, A., et al. Pulmonary vein contraction: Characterization of dynamic changes in pulmonary vein morphology using multiphase multislice computed tomography scanning. Heart Rhythm. 5 (12), 1645-1650 (2008).
- Spach, M. S., Barr, R. C., Jewett, P. H. Spread of excitation from the atrium into thoracic veins in human beings and dogs. The American Journal of Cardiology. 30 (8), 844-854 (1972).
- Scott McNutt, N., Weinstein, R. S. Membrane ultrastructure at mammalian intercellular junctions. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 26, 45-101 (1973).
- Barr, L., Dewey, M. M., Berger, W. Propagation of action potentials and the structure of the nexus in cardiac muscle. Journal of General Physiology. 48 (5), 797-823 (1965).
- Kawamura, K., Konishi, T. Ultrastructure of the cell junction of heart muscle with special reference to its functional significance in excitation conduction and to the concept of "disease of intercalated disc". Japanese Circulation Journal. 31 (11), 1533-1543 (1967).
- Van Kempen, M. J., Fromaget, C., Gros, D., Moorman, A. F., Lamers, W. H. Spatial distribution of connexin43, the major cardiac gap junction protein, in the developing and adult rat heart. Circulation Research. 68 (6), 1638-1651 (1991).
- Verheule, S. Tissue structure and connexin expression of canine pulmonary veins. Cardiovascular Research. 55 (4), 727-738 (2002).
- Xiao, Y., et al. Expression of connexin 43, ion channels and Ca2+-handling proteins in rat pulmonary vein cardiomyocytes. Experimental and Therapeutic Medicine. 12 (5), 3233-3241 (2016).
- Xia, R., et al. Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (166), (2020).
- Tomsits, P., et al. Medetomidine/midazolam/fentanyl narcosis alters cardiac autonomic tone leading to conduction disorders and arrhythmias in mice. Lab Animal. 52 (4), 85-92 (2023).
- Xia, R., et al. Isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node. Journal of Visualized Experiments. (171), (2021).
- Bredeloux, P., Pasqualin, C., Bordy, R., Maupoil, V., Findlay, I. Automatic activity arising in cardiac muscle sleeves of the pulmonary vein. Biomolecules. 12 (1), 23 (2021).
- Chen, P. S., et al. The mechanisms of atrial fibrillation. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 17, S2-S7 (2006).
- Thibault, S., Ton, A. -. T., Huynh, F., Fiset, C. Connexin lateralization contributes to male susceptibility to atrial fibrillation. International Journal of Molecular Sciences. 23 (18), 10696 (2022).
