Questo articolo descrive una procedura per produrre iTenociti generando cellule stromali mesenchimali derivate da iPSC con sovraespressione combinata di Scleraxis utilizzando un vettore lentivirale e stretching uniassiale tramite un bioreattore 2D.
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Articolo metodologico
Generazione di itenociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte tramite sovraespressione combinata della sclerassi e tensione uniassiale 2D
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le sfide odierne nella riparazione dei tendini e dei legamenti richiedono l'identificazione di un candidato adatto ed efficace per la terapia cellulare per promuovere la rigenerazione del tendine. Le cellule stromali mesenchimali (MSC) sono state esplorate come potenziale strategia di ingegneria tissutale per la riparazione dei tendini. Sebbene siano multipotenti e abbiano un potenziale rigenerativo in vivo, sono limitati nella loro capacità di auto-rinnovamento e mostrano eterogeneità fenotipica. Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) possono aggirare queste limitazioni grazie alla loro elevata capacità di auto-rinnovamento e alla plasticità di sviluppo senza pari. Nello sviluppo dei tenociti, la sclerassi (Scx) è un regolatore molecolare diretto cruciale della differenziazione tendinea. Inoltre, è stato dimostrato che la meccanoregolazione è un elemento centrale che guida lo sviluppo e la guarigione del tendine embrionale. Per questo motivo, abbiamo sviluppato un protocollo per incapsulare l'effetto sinergico della stimolazione biologica e meccanica che può essere essenziale per la generazione di tenociti. Le iPSC sono state indotte a diventare cellule stromali mesenchimali (iMSC) e sono state caratterizzate con i classici marcatori delle cellule stromali mesenchimali tramite citometria a flusso. Successivamente, utilizzando un vettore lentivirale, le iMSC sono state trasdotte per sovraesprimere stabilmente SCX (iMSCSCX+). Queste cellule iMSCSCX+ possono essere ulteriormente maturate in iTenociti tramite carico di trazione uniassiale utilizzando un bioreattore 2D. Le cellule risultanti sono state caratterizzate dall'osservazione della sovraregolazione dei marcatori tendinei precoci e tardivi, nonché della deposizione di collagene. Questo metodo di generazione di iTenociti può essere utilizzato per aiutare i ricercatori a sviluppare una fonte di cellule allogeniche potenzialmente illimitata per applicazioni di terapia cellulare tendinea.
Introduzione
Per affrontare i problemi contemporanei nella riparazione di tendini e legamenti, è necessario disporre di una cellula candidata pertinente adatta alle terapie cellulari. Una via di indagine nell'ingegneria tissutale per la riparazione dei tendini coinvolge l'esplorazione delle cellule stromali mesenchimali derivate dal midollo osseo (BM-MSC) e delle cellule stromali derivate dal tessuto adiposo (ASC) come potenziali strategie. Queste cellule hanno capacità multipotenti, grande abbondanza e potenziale rigenerativo in vivo. Inoltre, hanno mostrato una maggiore capacità di guarigione e migliori risultati funzionali nei modelli animali1. ....
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Protocollo
Questo protocollo per la produzione di iTenociti può essere condotto in tre fasi principali: da iPSC a iMSC (10 giorni), da iMSC a iMSCSCX+ (2 settimane), da iMSCSCX+ a iTenociti (minimo 4 giorni). Ogni fase principale del protocollo può essere messa in pausa e riavviata in un secondo momento, a seconda della tempistica sperimentale. Per i metodi coinvolti nella coltura delle cellule, devono essere impiegate tecniche sterili. Tutte le cellule di questo protocollo devono essere coltivate a 37 °C, 5% di CO2 e 95% di umidità.
1. Induzione di iPSC umane in cellule stromali mesenchimali indotte (iMSC)
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Risultati
Differenziazione delle iPSC umane in iMSCs
Come descritto in precedenza, l'attuale protocollo per differenziare le iPSC in iMSC prevede la formazione di corpi embrioidi2. Questo processo richiede circa dieci giorni per indurre le iMSC dalle iPSC (Figura 1A). Tuttavia, si consiglia vivamente di passare gli iMSC appena generati almeno due volte. Questo non solo aiuta a eliminare la necessità di piastre rivestite di gelatina, ma stabilisce anche un'es.......
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Discussione
In questo protocollo, gli itenociti sono generati attraverso tre fasi principali: (1) induzione di iPSC a iMSC, (2) sovraespressione di SCX utilizzando un vettore lentivirale e (3) maturazione delle cellule attraverso la tensione uniassiale 2D.
Il protocollo presentato per differenziare le iPSC in iMSC è stato precedentemente descritto dal nostro gruppo2. Da quella pubblicazione, sono stati sviluppati numerosi protocolli, tra cui un protocollo consolidato per l'utilizzo.......
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Dichiarazioni
Tutti gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Questo studio è stato parzialmente supportato dal NIH/NIAMS K01AR071512 e dal CIRM DISC0-14350 a Dmitriy Sheyn. I due plasmidi di confezionamento dei lentivirus sono stati donati dal laboratorio Simon Knott (Dipartimento di Scienze Biomediche, Cedars-Sinai Medical Center).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 2-mercaptoetanolo | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Accutase | StemCell Technologies | 7920 | reagente di dissociazione cellulare |
| Soluzione antibiotico-antimicotica | Thermofisher | 15240096 | |
| Anti-CD105 | Ancell | 326-050 | |
| APC topo anti-umano CD44 | BD Biosciences | 559942 | |
| APC mouse IgG2 K controllo dell'isotipo | BD Biosciences | 555745 | |
| BenchMark fetale siero bovino | GeminiBio | 100-106 | |
| Biglycan | Thermofisher | Hs00959143_m1 | |
| Siero bovino albumina | Millipore Sigma | A3733 | |
| Collagene di tipo I alfa 1 catena umana Taqman primer | Thermofisher | Hs00164004_m1 | |
| Collagene di tipo III alfa 1 catena umana Taqman primer | Thermofisher | Hs00943809_m1 | |
| Dimetil solfossido | Millipore Sigma | D8418 | |
| DMEM, basso glucosio, piruvato, senza glutammina, senza fenolo rosso | Thermofisher | 11054020 | |
| Eagle's minimum essential medium (EMEM) | ATCC | 30-2003 | |
| Fibronectina plasma bovino | Sigma Aldrich | F1141 | |
| FITC topo anti-umano CD90 | BD Biosciences | 555595 | |
| Gelatina da pelle suina | Sigma Aldrich | G1890 | |
| Capra anti Topo IgG1-PE | Bio-Rad | STAR117 | |
| HEK 293T/17 | ATCC | CRL-11268 | |
| IMDM, senza fenolo rosso | Thermofisher | 21056023 | |
| iPSC: 83i-cntr-33n1 | Cedars-Sinai iPSC Core Facility | N/A | https://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/ |
| Anticorpo per il controllo degli isotipi, topo IgG2a-FITC | Miltenyi Biotec | 130-113-271 | |
| Sostituzione del siero KnockOut | Thermofisher | 10828010 | |
| acido L-ascorbico | Sigma Aldrich | A4544 | |
| L-Glutammina | Thermofisher | 2503081 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | matrice a membrana basale |
| MechanoCulture FX | CellScale | N/A | apparato di stretching |
| MEM soluzione di aminoacidi non essenziali | Thermofisher | 11140050 | |
| Mohawk umano Taqman primer | Thermofisher | Hs00543190_m1 | |
| mTeSR Plus | StemCell Technologies | 100-0276 | |
| PBS | Thermofisher | 10010023 | |
| Recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine Un primer Taqman umano | Thermofisher | Hs00998018_m1 | |
| Poli(2-idrossietilmetacrilato) | Sigma Aldrich | 192066 | |
| Reagenti per infezione/trasfezione di Polybrene | Millipore Sigma | TR-1003 | |
| Ricombinante umano TGF-beta 1 proteina umana Taqman primer | RnD Systems | 240-B | |
| Scleraxis umano Taqman primer | Thermofisher | Hs03054634_g1 | |
| SCXA (SCX) (NM_00108050514) umano taggato ORF clone | OriGene | RC224305L4 | |
| Piastre in silicone | CellScale | N/A | |
| Sodio azide | Millipore Sigma | S2002 | |
| Tenascin C Primer Taqman umano | Thermofisher | Hs00370384_m1 | |
| Tenomodulin primer Taqman umano | Thermofisher | Hs00223332_m1 | |
| Trombospondina 4 primer Taqman umano | Thermofisher | Hs00170261_m1 | |
| Reagente di trasfezione, BioT | Bioland Scientific LLC | B01-01 | |
| Tripsina-EDTA (0,25%) | Thermofisher | 25200072 | |
| Membro della famiglia delle proteine che promuovono la polimerizzazione della tubulina 3 | Thermofisher | Hs03043892_m1 | |
| Dicloridrato di Y-27632 | Biogems | 1293823 |
Riferimenti
- Lim, W. L., Liau, L. L., Ng, M. H., Chowdhury, S. R., Law, J. X. Current progress in tendon and ligament tissue engineering. Tissue Engineering and Regenerative. 16 (6), 549-571 (2019).
- Sheyn, D., et al.
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Ristampe e permessi
