Generering af inducerede pluripotente stamcelleafledte iTenocytter via kombineret scleraksoverekspression og 2D uniaxial spænding

Summary

Denne artikel beskriver en procedure til fremstilling af iTenocytter ved at generere iPSC-afledte mesenkymale stromale celler med kombineret overekspression af Scleraxis ved hjælp af en lentiviral vektor og uniaxial strækning via en 2D-bioreaktor.

Abstract

Dagens udfordringer inden for sene- og ledbåndsreparation kræver identifikation af en passende og effektiv kandidat til cellebaseret terapi for at fremme seneregenerering. Mesenkymale stromale celler (MSC’er) er blevet undersøgt som en potentiel vævsteknisk strategi til reparation af sener. Mens de er multipotente og har regenerativt potentiale in vivo, er de begrænsede i deres selvfornyelseskapacitet og udviser fænotypisk heterogenitet. Inducerede pluripotente stamceller (iPSC’er) kan omgå disse begrænsninger på grund af deres høje selvfornyelseskapacitet og uovertruffen udviklingsmæssige plasticitet. I tenocytudvikling er Scleraxis (Scx) en afgørende direkte molekylær regulator af senedifferentiering. Derudover har mekanoregulering vist sig at være et centralt element, der styrer embryonal seneudvikling og heling. Som sådan har vi udviklet en protokol til at indkapsle den synergistiske virkning af biologisk og mekanisk stimulering, der kan være afgørende for generering af tenocytter. iPSC’er blev induceret til at blive mesenkymale stromale celler (iMSC’er) og blev karakteriseret med klassiske mesenkymale stromale cellemarkører via flowcytometri. Dernæst blev iMSC’erne ved hjælp af en lentiviral vektor transduceret til stabilt at overudtrykke SCX (iMSC^SCX+). Disse iMSC^SCX+ celler kan modnes yderligere til iTenocytter via uniaxial trækbelastning ved hjælp af en 2D bioreaktor. De resulterende celler blev karakteriseret ved at observere opreguleringen af tidlige og sene senemarkører såvel som kollagenaflejring. Denne metode til generering af iTenocytter kan bruges til at hjælpe forskere med at udvikle en potentielt ubegrænset allogen cellekilde til senecelleterapiapplikationer.

Introduction

For at tackle de moderne problemer i sener og ledbåndsreparation er der et krav om en relevant cellekandidat, der er egnet til cellebaserede terapier. En undersøgelsesvej inden for vævsteknik til senereparation involverer udforskning af knoglemarvsafledte mesenkymale stromale celler (BM-MSC’er) og fedtvævsafledte stromale celler (ASC’er) som potentielle strategier. Disse celler har multipotent kapacitet, stor overflod og regenerativt potentiale in vivo. Derudover har de vist forbedret helingsevne og forbedrede funktionelle resultater i dyremodeller¹. Ikke desto mindre udviser disse celler begrænsede selvfornyelsesevner, fænotypisk mangfoldighed og især begrænset kapacitet til senedannelse. Induceret pluripotent stamcelleteknologi (iPSC) tilbyder en løsning på disse begrænsninger på grund af dens bemærkelsesværdige selvfornyelseskapacitet og uovertruffen udviklingstilpasningsevne. Vores forskerteam og andre har opnået en vellykket differentiering af iPSC’er i mesenkymale stromale cellelignende enheder (iMSC’er)^2,3. Som sådan har iMSC’er potentialet til at være en allogen kilde til senecelleterapiapplikationer.

Scleraxis (SCX) er en transkriptionsfaktor, der er afgørende for seneudvikling og betragtes som den tidligste detekterbare markør for differentierede tenocytter. Derudover aktiverer SCX nedstrøms senedifferentieringsmarkører, herunder type 1a1 kædekollagen 1 (COL1a1), mohawk (MKX) og tenomodulin (TNMD), blandt andet ^4,5,6. Andre gener udtrykt under senemodning omfatter tubulinpolymerisationsfremmende proteinfamiliemedlem 3 (TPPP3) og blodpladeafledt vækstfaktorreceptor alfa (PDGFRa)⁷. Mens disse gener er afgørende for seneudvikling og modning, er de desværre ikke unikke for senevæv og udtrykkes i andre muskuloskeletale væv som knogler eller brusk ^5,7.

Ud over ekspressionen af markører under seneudvikling er mekanostimulering et væsentligt element for embryonal seneudvikling og heling ^4,5,6. Sener er mekanoresponsive, og deres vækstmønstre ændres som reaktion på deres miljø. På molekylært niveau påvirker biomekaniske signaler udviklingen, modningen, vedligeholdelsen og helingsresponserne af tenocytter⁸. Forskellige bioreaktorsystemer er blevet brugt til at modellere fysiologiske belastninger og biomekaniske signaler. Nogle af disse modelsystemer inkluderer ex vivo-vævsbelastning, 2D-cellebelastningssystemer, der anvender biaksial eller uniaxial spænding, og 3D-systemer, der bruger stilladser og hydrogeler ^9,10. 2D-systemer er fordelagtige, når man studerer den mekaniske stimulerings virkninger på enten senespecifikke gener eller cellernes morfologi i forbindelse med celleskæbne, mens 3D-systemer mere præcist kan replikere celle-ECM-interaktioner ^9,10.

I 2D-belastningssystemer er belastningen mellem cellerne og kultursubstratet homogen, hvilket betyder, at den påførte belastning på cellernes cytoskelet kan kontrolleres fuldt ud. I sammenligning med bi-aksial belastning er uniaxial belastning mere fysiologisk relevant, da tenocytter overvejende udsættes for uniaxial belastning fra kollagenbundter in vivo⁹. Det konstateres, at sener under daglige aktiviteter udsættes for uniaxial trækbelastning op til 6% belastning¹¹. Specifikt har tidligere undersøgelser vist, at belastning inden for de fysiologiske områder på 4% -5% har vist sig at fremme tenogen differentiering ved at bevare senerelateret markørekspression som SCX og TNMD samt øget kollagenproduktion ^9,10. Stammer på mere end 10% kan være traumatisk relevante, men ikke fysiologisk relevante^12,13.

Her præsenteres en protokol, der tager højde for den synergistiske virkning af mekanisk og biologisk stimulering, som kan være afgørende for dannelsen af tenocytter. Vi beskriver først en reproducerbar metode til at inducere iPSC’er i iMSC’er via kortvarig eksponering af embryoidlegemer for vækstfaktorer, bekræftet af MSC-overflademarkører ved hjælp af flowcytometri. Vi beskriver derefter en lentiviral transduktionsmetode til at konstruere iMSC’er til at have stabil overekspression af SCX (iMSC^SCX+). For yderligere cellemodning podes iMSC^SCX+ i fibronectinbelagte silikoneplader og gennemgår en optimeret uniaxial spændingsprotokol ved hjælp af CellScale MCFX-bioreaktor. Det tenogene potentiale blev bekræftet ved at observere opregulering af tidlige og sene senemarkører samt kollagenaflejring¹⁴. Denne metode til generering af iTenocytter er et proof-of-concept, der kan tilbyde en ubegrænset hyldevare, allogen kilde til senecelleterapiapplikationer.

Protocol

Denne protokol til fremstilling af iTenocytter kan udføres i tre hovedtrin: iPSC’er til iMSC’er (10 dage), iMSC til iMSCSCX+ (2 uger), iMSCSCX+ til iTenocytter (minimum 4 dage). Hvert større trin i protokollen kan sættes på pause og genstartes senere, afhængigt af den eksperimentelle tidslinje. For metoder til dyrkning af celler bør sterile teknikker anvendes. Alle celler i denne protokol skal dyrkes ved 37 ° C, 5% CO2 og 95% fugtighed. 1. Human iP…

Representative Results

Differentiering af menneskelige iPSC’er i forhold til iMSC’erSom tidligere beskrevet indebærer den nuværende protokol til differentiering af iPSC’er i iMSC’er dannelsen af embryoidlegemer2. Denne proces tager ca. ti dage at inducere iMSC’er fra iPSC’er (figur 1A). Det anbefales dog stærkt at passere de nyligt genererede iMSC’er mindst to gange. Dette hjælper ikke kun med at eliminere behovet for gelatinebelagte plader, men etablerer også stab…

Discussion

I denne protokol genereres iTenocytter gennem tre hovedtrin: (1) induktion af iPSC’er til iMSC’er, (2) overekspression af SCX ved hjælp af en lentiviral vektor og (3) modning af celler gennem 2D uniaxial spænding.

Den protokol, der præsenteres for differentiering af iPSC’er i iMSC’er, er tidligere beskrevet af vores gruppe². Siden denne offentliggørelse er der udviklet adskillige protokoller, herunder en etableret protokol til brug af iMSC’er i kliniske forsøg 21,2…

Materials

2-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148
Accutase	StemCell Technologies	7920	cell dissociation reagent
Antibiotic-antimycotic solution	Thermofisher	15240096
Anti-CD105	Ancell	326-050
APC mouse anti-human CD44	BD Biosciences	559942
APC mouse IgG2 K isotype control	BD Biosciences	555745
BenchMark fetal bovine serum	GeminiBio	100-106
Biglycan	Thermofisher	Hs00959143_m1
Bovine serum albumin	Millipore Sigma	A3733
Collagen type I alpha 1 chain human Taqman primer	Thermofisher	Hs00164004_m1
Collagen type III alpha 1 chain human Taqman primer	Thermofisher	Hs00943809_m1
Dimethyl sulfoxide	Millipore Sigma	D8418
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red	Thermofisher	11054020
Eagle's minimum essential medium (EMEM)	ATCC	30-2003
Fibronectin bovine plasma	Sigma Aldrich	F1141
FITC mouse anti-human CD90	BD Biosciences	555595
Gelatin from porcine skin	Sigma Aldrich	G1890
Goat anti Mouse IgG1-PE	Bio-Rad	STAR117
HEK 293T/17	ATCC	CRL-11268
IMDM, no phenol red	Thermofisher	21056023
iPSCs: 83i-cntr-33n1	Cedars-Sinai iPSC Core Facility	N/A	https://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/
Isotype Control Antibody, mouse IgG2a-FITC	Miltenyi Biotec	130-113-271
KnockOut serum replacement	Thermofisher	10828010
L-ascorbic acid	Sigma Aldrich	A4544
L-Glutamine	Thermofisher	2503081
Matrigel	Corning	354230	basement membrane matrix
MechanoCulture FX	CellScale	N/A	stretching apparatus
MEM non-essential amino acids solution	Thermofisher	11140050
Mohawk human Taqman primer	Thermofisher	Hs00543190_m1
mTeSR Plus	StemCell Technologies	100-0276
PBS	Thermofisher	10010023
Platelet-derived growth factor receptor A human Taqman primer	Thermofisher	Hs00998018_m1
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)	Sigma Aldrich	192066
Polybrene infection/transfection reagents	Millipore Sigma	TR-1003
Recombinant human  TGF-beta 1 protein human Taqman primer	RnD Systems	240-B
Scleraxis human Taqman primer	Thermofisher	Hs03054634_g1
SCXA (SCX) (NM_00108050514) human tagged ORF clone	OriGene	RC224305L4
Silicone plates	CellScale	N/A
Sodium azide	Millipore Sigma	S2002
Tenascin C human Taqman primer	Thermofisher	Hs00370384_m1
Tenomodulin human Taqman primer	Thermofisher	Hs00223332_m1
Thrombospondin 4 human Taqman primer	Thermofisher	Hs00170261_m1
Transfection reagent, BioT	Bioland Scientific LLC	B01-01
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermofisher	25200072
Tubulin polymerization promoting protein family member 3	Thermofisher	Hs03043892_m1
Y-27632 dihydrochloride	Biogems	1293823