Dit artikel beschrijft een procedure om iTenocyten te produceren door iPSC-afgeleide mesenchymale stromale cellen te genereren met gecombineerde overexpressie van Scleraxis met behulp van een lentivirale vector en uniaxiale rek via een 2D-bioreactor.
De huidige uitdagingen op het gebied van pees- en ligamentherstel vereisen de identificatie van een geschikte en effectieve kandidaat voor celgebaseerde therapie om peesregeneratie te bevorderen. Mesenchymale stromale cellen (MSC’s) zijn onderzocht als een mogelijke weefselmanipulatiestrategie voor peesherstel. Hoewel ze multipotent zijn en in vivo regeneratief potentieel hebben, zijn ze beperkt in hun zelfvernieuwingsvermogen en vertonen ze fenotypische heterogeniteit. Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC’s) kunnen deze beperkingen omzeilen vanwege hun hoge zelfvernieuwingscapaciteit en ongeëvenaarde ontwikkelingsplasticiteit. Bij de ontwikkeling van tenocyten is Scleraxis (Scx) een cruciale directe moleculaire regulator van peesdifferentiatie. Bovendien is aangetoond dat mechanoregulatie een centraal element is dat de ontwikkeling en genezing van embryonale pezen begeleidt. Daarom hebben we een protocol ontwikkeld om het synergetische effect van biologische en mechanische stimulatie in te kapselen dat essentieel kan zijn voor het genereren van tenocyten. iPSC’s werden geïnduceerd om mesenchymale stromale cellen (iMSC’s) te worden en werden gekarakteriseerd met klassieke mesenchymale stromale celmarkers via flowcytometrie. Vervolgens werden de iMSC’s met behulp van een lentivirale vector getransduceerd om SCX stabiel tot overexpressie te brengen (iMSCSCX+). Deze iMSCSCX+- cellen kunnen verder worden gerijpt tot iTenocyten via uniaxiale trekbelasting met behulp van een 2D-bioreactor. De resulterende cellen werden gekenmerkt door het observeren van de opregulatie van vroege en late peesmarkers, evenals collageenafzetting. Deze methode voor het genereren van iTenocyten kan worden gebruikt om onderzoekers te helpen bij het ontwikkelen van een potentieel onbeperkte kant-en-klare allogene celbron voor peesceltherapietoepassingen.
Om de hedendaagse problemen bij pees- en ligamentherstel aan te pakken, is er behoefte aan een relevante celkandidaat die geschikt is voor celgebaseerde therapieën. Een onderzoeksrichting in weefselmanipulatie voor peesherstel omvat de verkenning van beenmerg-afgeleide mesenchymale stromale cellen (BM-MSC’s) en vetweefsel-afgeleide stromale cellen (ASC’s) als mogelijke strategieën. Deze cellen hebben een multipotent vermogen, een grote overvloed en een regeneratief potentieel in vivo. Bovendien hebben ze een verbeterd genezingsvermogen en verbeterde functionele resultaten aangetoond indiermodellen1. Desalniettemin vertonen deze cellen een beperkt zelfvernieuwingsvermogen, fenotypische diversiteit en met name een beperkt vermogen tot peesvorming. Geïnduceerde pluripotente stamceltechnologie (iPSC) biedt een oplossing voor deze beperkingen vanwege het opmerkelijke zelfvernieuwende vermogen en het ongeëvenaarde aanpassingsvermogen in de ontwikkeling. Ons onderzoeksteam en anderen hebben een succesvolle differentiatie van iPSC’s in mesenchymale stromale celachtige entiteiten (iMSC’s) bereikt2,3. Als zodanig hebben iMSC’s het potentieel om een allogene bron te zijn voor peesceltherapietoepassingen.
Scleraxis (SCX) is een transcriptiefactor die essentieel is voor de ontwikkeling van pezen en wordt beschouwd als de vroegst detecteerbare marker voor gedifferentieerde tenocyten. Bovendien activeert SCX stroomafwaartse peesdifferentiatiemarkers, waaronder type 1a1-keten collageen 1 (COL1a1), hanenkam (MKX) en tenomoduline (TNMD), onder andere 4,5,6. Andere genen die tijdens peesrijping tot expressie komen, zijn onder meer tubulinepolymerisatiebevorderend eiwitfamilielid 3 (TPPP3) en van bloedplaatjes afgeleide groeifactorreceptor-alfa (PDGFRa)7. Hoewel deze genen essentieel zijn voor de ontwikkeling en rijping van pezen, zijn ze helaas niet uniek voor peesweefsel en komen ze tot expressie in andere musculoskeletale weefsels zoals bot ofkraakbeen5,7.
Naast de expressie van markers tijdens de peesontwikkeling, is mechanostimulatie een essentieel element voor de ontwikkeling en genezing van embryonale pezen 4,5,6. Pezen zijn mechanoresponsief en hun groeipatronen veranderen als reactie op hun omgeving. Op moleculair niveau beïnvloeden biomechanische signalen de ontwikkeling, rijping, onderhoud en genezingsreacties van tenocyten8. Er zijn verschillende bioreactorsystemen gebruikt om fysiologische belastingen en biomechanische signalen te modelleren. Sommige van deze modelsystemen omvatten ex vivo weefselbelasting, 2D-cellaadsystemen die biaxiale of uniaxiale spanning toepassen, en 3D-systemen die steigers en hydrogels gebruiken 9,10. 2D-systemen zijn voordelig bij het bestuderen van de effecten van de mechanische stimulatie op peesspecifieke genen of de morfologie van de cellen in de context van het lot van de cel, terwijl 3D-systemen de interacties tussen cel en ECM nauwkeuriger kunnen repliceren 9,10.
In 2D-laadsystemen is de spanning tussen de cellen en het kweeksubstraat homogeen, wat betekent dat de uitgeoefende belasting op het cytoskelet van de cellen volledig kan worden gecontroleerd. In vergelijking met bi-axiale belasting is uniaxiale belasting fysiologisch relevanter, aangezien tenocyten in vivovoornamelijk worden blootgesteld aan uniaxiale belasting door collageenbundels 9. Het blijkt dat pezen tijdens dagelijkse activiteiten worden blootgesteld aan uniaxiale trekbelasting tot 6% belasting11. In het bijzonder hebben eerdere studies aangetoond dat belasting binnen het fysiologische bereik van 4%-5% tenogene differentiatie bevordert door peesgerelateerde markerexpressie zoals SCX en TNMD te behouden, evenals een verhoogde collageenproductie 9,10. Verrekkingen van meer dan 10% kunnen traumatisch relevant zijn, maar fysiologisch niet relevant12,13.
Hier wordt een protocol gepresenteerd dat rekening houdt met het synergetische effect van mechanische en biologische stimulatie die essentieel kan zijn voor de aanmaak van tenocyten. We beschrijven eerst een reproduceerbare methode om iPSC’s in iMSC’s te induceren via kortdurende blootstelling van embryoïde lichamen aan groeifactoren, bevestigd door MSC-oppervlaktemarkers met behulp van flowcytometrie. Vervolgens beschrijven we een lentivirale transductiemethode om iMSC’s te manipuleren om een stabiele overexpressie van SCX (iMSCSCX+) te hebben. Voor verdere celrijping worden de iMSCSCX+ gezaaid in met fibronectine gecoate siliconenplaten en ondergaan ze een geoptimaliseerd uniaxiaal spanningsprotocol met behulp van de CellScale MCFX-bioreactor. Het tenogene potentieel werd bevestigd door het observeren van de opregulatie van vroege en late peesmarkers, evenals collageenafzetting14. Deze methode voor het genereren van iTenocyten is een proof-of-concept dat een onbeperkte kant-en-klare, allogene bron kan bieden voor peesceltherapietoepassingen.
In dit protocol worden iTenocyten gegenereerd door middel van drie hoofdstappen: (1) inductie van iPSC’s tot iMSC’s, (2) overexpressie van SCX met behulp van een lentivirale vector en (3) rijping van cellen door 2D uniaxiale spanning.
Het gepresenteerde protocol voor het differentiëren van iPSC’s in iMSC’s is eerder beschreven door onze groep2. Sinds die publicatie zijn er tal van protocollen ontwikkeld, waaronder een vastgesteld protocol voor het gebruik van iMSC’s in…
The authors have nothing to disclose.
Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door de NIH/NIAMS K01AR071512 en CIRM DISC0-14350 aan Dmitriy Sheyn. De twee plasmiden die lentivirusverpakkingen verpakken, waren een geschenk van het Simon Knott-laboratorium (Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center).
2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
Accutase | StemCell Technologies | 7920 | cell dissociation reagent |
Antibiotic-antimycotic solution | Thermofisher | 15240096 | |
Anti-CD105 | Ancell | 326-050 | |
APC mouse anti-human CD44 | BD Biosciences | 559942 | |
APC mouse IgG2 K isotype control | BD Biosciences | 555745 | |
BenchMark fetal bovine serum | GeminiBio | 100-106 | |
Biglycan | Thermofisher | Hs00959143_m1 | |
Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A3733 | |
Collagen type I alpha 1 chain human Taqman primer | Thermofisher | Hs00164004_m1 | |
Collagen type III alpha 1 chain human Taqman primer | Thermofisher | Hs00943809_m1 | |
Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D8418 | |
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Thermofisher | 11054020 | |
Eagle's minimum essential medium (EMEM) | ATCC | 30-2003 | |
Fibronectin bovine plasma | Sigma Aldrich | F1141 | |
FITC mouse anti-human CD90 | BD Biosciences | 555595 | |
Gelatin from porcine skin | Sigma Aldrich | G1890 | |
Goat anti Mouse IgG1-PE | Bio-Rad | STAR117 | |
HEK 293T/17 | ATCC | CRL-11268 | |
IMDM, no phenol red | Thermofisher | 21056023 | |
iPSCs: 83i-cntr-33n1 | Cedars-Sinai iPSC Core Facility | N/A | https://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/ |
Isotype Control Antibody, mouse IgG2a-FITC | Miltenyi Biotec | 130-113-271 | |
KnockOut serum replacement | Thermofisher | 10828010 | |
L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
L-Glutamine | Thermofisher | 2503081 | |
Matrigel | Corning | 354230 | basement membrane matrix |
MechanoCulture FX | CellScale | N/A | stretching apparatus |
MEM non-essential amino acids solution | Thermofisher | 11140050 | |
Mohawk human Taqman primer | Thermofisher | Hs00543190_m1 | |
mTeSR Plus | StemCell Technologies | 100-0276 | |
PBS | Thermofisher | 10010023 | |
Platelet-derived growth factor receptor A human Taqman primer | Thermofisher | Hs00998018_m1 | |
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) | Sigma Aldrich | 192066 | |
Polybrene infection/transfection reagents | Millipore Sigma | TR-1003 | |
Recombinant human TGF-beta 1 protein human Taqman primer | RnD Systems | 240-B | |
Scleraxis human Taqman primer | Thermofisher | Hs03054634_g1 | |
SCXA (SCX) (NM_00108050514) human tagged ORF clone | OriGene | RC224305L4 | |
Silicone plates | CellScale | N/A | |
Sodium azide | Millipore Sigma | S2002 | |
Tenascin C human Taqman primer | Thermofisher | Hs00370384_m1 | |
Tenomodulin human Taqman primer | Thermofisher | Hs00223332_m1 | |
Thrombospondin 4 human Taqman primer | Thermofisher | Hs00170261_m1 | |
Transfection reagent, BioT | Bioland Scientific LLC | B01-01 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermofisher | 25200072 | |
Tubulin polymerization promoting protein family member 3 | Thermofisher | Hs03043892_m1 | |
Y-27632 dihydrochloride | Biogems | 1293823 |