Generazione di itenociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte tramite sovraespressione combinata della sclerassi e tensione uniassiale 2D
Summary
Questo articolo descrive una procedura per produrre iTenociti generando cellule stromali mesenchimali derivate da iPSC con sovraespressione combinata di Scleraxis utilizzando un vettore lentivirale e stretching uniassiale tramite un bioreattore 2D.
Abstract
Le sfide odierne nella riparazione dei tendini e dei legamenti richiedono l’identificazione di un candidato adatto ed efficace per la terapia cellulare per promuovere la rigenerazione del tendine. Le cellule stromali mesenchimali (MSC) sono state esplorate come potenziale strategia di ingegneria tissutale per la riparazione dei tendini. Sebbene siano multipotenti e abbiano un potenziale rigenerativo in vivo, sono limitati nella loro capacità di auto-rinnovamento e mostrano eterogeneità fenotipica. Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) possono aggirare queste limitazioni grazie alla loro elevata capacità di auto-rinnovamento e alla plasticità di sviluppo senza pari. Nello sviluppo dei tenociti, la sclerassi (Scx) è un regolatore molecolare diretto cruciale della differenziazione tendinea. Inoltre, è stato dimostrato che la meccanoregolazione è un elemento centrale che guida lo sviluppo e la guarigione del tendine embrionale. Per questo motivo, abbiamo sviluppato un protocollo per incapsulare l’effetto sinergico della stimolazione biologica e meccanica che può essere essenziale per la generazione di tenociti. Le iPSC sono state indotte a diventare cellule stromali mesenchimali (iMSC) e sono state caratterizzate con i classici marcatori delle cellule stromali mesenchimali tramite citometria a flusso. Successivamente, utilizzando un vettore lentivirale, le iMSC sono state trasdotte per sovraesprimere stabilmente SCX (iMSCSCX+). Queste cellule iMSCSCX+ possono essere ulteriormente maturate in iTenociti tramite carico di trazione uniassiale utilizzando un bioreattore 2D. Le cellule risultanti sono state caratterizzate dall’osservazione della sovraregolazione dei marcatori tendinei precoci e tardivi, nonché della deposizione di collagene. Questo metodo di generazione di iTenociti può essere utilizzato per aiutare i ricercatori a sviluppare una fonte di cellule allogeniche potenzialmente illimitata per applicazioni di terapia cellulare tendinea.
Introduction
Per affrontare i problemi contemporanei nella riparazione di tendini e legamenti, è necessario disporre di una cellula candidata pertinente adatta alle terapie cellulari. Una via di indagine nell’ingegneria tissutale per la riparazione dei tendini coinvolge l’esplorazione delle cellule stromali mesenchimali derivate dal midollo osseo (BM-MSC) e delle cellule stromali derivate dal tessuto adiposo (ASC) come potenziali strategie. Queste cellule hanno capacità multipotenti, grande abbondanza e potenziale rigenerativo in vivo. Inoltre, hanno mostrato una maggiore capacità di guarigione e migliori risultati funzionali nei modelli animali1. Tuttavia, queste cellule mostrano limitate capacità di auto-rinnovamento, diversità fenotipica e, in particolare, limitata capacità di formazione dei tendini. La tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) offre una soluzione a questi vincoli grazie alla sua notevole capacità di auto-rinnovamento e all’adattabilità allo sviluppo senza pari. Il nostro team di ricerca e altri hanno raggiunto con successo la differenziazione delle iPSC in entità simili alle cellule stromali mesenchimali (iMSCs)2,3. In quanto tali, le iMSC hanno il potenziale per essere una fonte allogenica per applicazioni di terapia con cellule tendinee.
La sclerassi (SCX) è un fattore di trascrizione essenziale per lo sviluppo del tendine ed è considerato il primo marcatore rilevabile per i tenociti differenziati. Inoltre, SCX attiva i marcatori di differenziazione tendinea a valle, tra cui il collagene a catena 1 di tipo 1a1 (COL1a1), il mohawk (MKX) e la tenomodulina (TNMD), tra gli altri 4,5,6. Altri geni espressi durante la maturazione tendinea includono il membro della famiglia 3 della proteina che promuove la polimerizzazione della tubulina (TPPP3) e il recettore alfa del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFRa)7. Sebbene questi geni siano essenziali per lo sviluppo e la maturazione dei tendini, purtroppo non sono esclusivi del tessuto tendineo e sono espressi in altri tessuti muscoloscheletrici come l’osso o la cartilagine 5,7.
Oltre all’espressione di marcatori durante lo sviluppo tendineo, la meccanostimolazione è un elemento essenziale per lo sviluppo e la guarigione del tendine embrionale 4,5,6. I tendini sono meccanoreattivi e i loro modelli di crescita cambiano in risposta al loro ambiente. A livello molecolare, i segnali biomeccanici influenzano lo sviluppo, la maturazione, il mantenimento e le risposte di guarigione dei tenociti8. Vari sistemi di bioreattori sono stati utilizzati per modellare carichi fisiologici e segnali biomeccanici. Alcuni di questi sistemi modello includono il caricamento tissutale ex vivo, i sistemi di caricamento cellulare 2D che applicano una tensione biassiale o uniassiale e i sistemi 3D che utilizzano scaffold e idrogel 9,10. I sistemi 2D sono vantaggiosi quando si studiano gli effetti della stimolazione meccanica sui geni tendinei specifici o sulla morfologia delle cellule nel contesto del destino cellulare, mentre i sistemi 3D possono replicare in modo più accurato le interazioni cellula-ECM 9,10.
Nei sistemi di caricamento 2D, la deformazione tra le cellule e il substrato di coltura è omogenea, il che significa che il carico applicato sul citoscheletro delle cellule può essere completamente controllato. Rispetto al carico biassiale, il carico uniassiale è fisiologicamente più rilevante, poiché i tenociti sono prevalentemente soggetti a carico uniassiale da fasci di collagene in vivo9. Si è riscontrato che durante le attività quotidiane, i tendini sono soggetti a carico di trazione uniassiale fino al 6% di deformazione11. In particolare, studi precedenti hanno scoperto che il carico all’interno degli intervalli fisiologici del 4%-5% ha dimostrato di promuovere la differenziazione tenogenica preservando l’espressione di marcatori correlati ai tendini come SCX e TNMD, nonché l’aumento della produzione di collagene 9,10. Ceppi superiori al 10% possono essere traumaticamente rilevanti ma non fisiologicamente rilevanti 12,13.
Qui viene presentato un protocollo che tiene conto dell’effetto sinergico della stimolazione meccanica e biologica che può essere essenziale per la generazione dei tenociti. In primo luogo descriviamo un metodo riproducibile per indurre le iPSC nelle iMSC attraverso l’esposizione a breve termine dei corpi embrioidi ai fattori di crescita, confermato dai marcatori di superficie delle MSC utilizzando la citometria a flusso. Descriviamo quindi in dettaglio un metodo di trasduzione lentivirale per ingegnerizzare le iMSC in modo che abbiano una sovraespressione stabile di SCX (iMSCSCX+). Per un’ulteriore maturazione cellulare, gli iMSCSCX+ vengono seminati in piastre di silicone rivestite di fibronectina e sottoposti a un protocollo di tensione uniassiale ottimizzato utilizzando il bioreattore CellScale MCFX. Il potenziale tenogenico è stato confermato osservando la sovraregolazione dei marcatori tendinei precoci e tardivi, nonché la deposizione di collagene14. Questo metodo di generazione di iTenociti è un proof-of-concept che può offrire una fonte allogenica illimitata pronta all’uso per applicazioni di terapia con cellule tendinee.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo protocollo, gli itenociti sono generati attraverso tre fasi principali: (1) induzione di iPSC a iMSC, (2) sovraespressione di SCX utilizzando un vettore lentivirale e (3) maturazione delle cellule attraverso la tensione uniassiale 2D.
Il protocollo presentato per differenziare le iPSC in iMSC è stato precedentemente descritto dal nostro gruppo2. Da quella pubblicazione, sono stati sviluppati numerosi protocolli, tra cui un protocollo consolidato per l’utilizz…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato parzialmente supportato dal NIH/NIAMS K01AR071512 e dal CIRM DISC0-14350 a Dmitriy Sheyn. I due plasmidi di confezionamento dei lentivirus sono stati donati dal laboratorio Simon Knott (Dipartimento di Scienze Biomediche, Cedars-Sinai Medical Center).
Materials
| 2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Accutase | StemCell Technologies | 7920 | cell dissociation reagent |
| Antibiotic-antimycotic solution | Thermofisher | 15240096 | |
| Anti-CD105 | Ancell | 326-050 | |
| APC mouse anti-human CD44 | BD Biosciences | 559942 | |
| APC mouse IgG2 K isotype control | BD Biosciences | 555745 | |
| BenchMark fetal bovine serum | GeminiBio | 100-106 | |
| Biglycan | Thermofisher | Hs00959143_m1 | |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A3733 | |
| Collagen type I alpha 1 chain human Taqman primer | Thermofisher | Hs00164004_m1 | |
| Collagen type III alpha 1 chain human Taqman primer | Thermofisher | Hs00943809_m1 | |
| Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D8418 | |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Thermofisher | 11054020 | |
| Eagle's minimum essential medium (EMEM) | ATCC | 30-2003 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma Aldrich | F1141 | |
| FITC mouse anti-human CD90 | BD Biosciences | 555595 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma Aldrich | G1890 | |
| Goat anti Mouse IgG1-PE | Bio-Rad | STAR117 | |
| HEK 293T/17 | ATCC | CRL-11268 | |
| IMDM, no phenol red | Thermofisher | 21056023 | |
| iPSCs: 83i-cntr-33n1 | Cedars-Sinai iPSC Core Facility | N/A | https://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/ |
| Isotype Control Antibody, mouse IgG2a-FITC | Miltenyi Biotec | 130-113-271 | |
| KnockOut serum replacement | Thermofisher | 10828010 | |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
| L-Glutamine | Thermofisher | 2503081 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | basement membrane matrix |
| MechanoCulture FX | CellScale | N/A | stretching apparatus |
| MEM non-essential amino acids solution | Thermofisher | 11140050 | |
| Mohawk human Taqman primer | Thermofisher | Hs00543190_m1 | |
| mTeSR Plus | StemCell Technologies | 100-0276 | |
| PBS | Thermofisher | 10010023 | |
| Platelet-derived growth factor receptor A human Taqman primer | Thermofisher | Hs00998018_m1 | |
| Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) | Sigma Aldrich | 192066 | |
| Polybrene infection/transfection reagents | Millipore Sigma | TR-1003 | |
| Recombinant human TGF-beta 1 protein human Taqman primer | RnD Systems | 240-B | |
| Scleraxis human Taqman primer | Thermofisher | Hs03054634_g1 | |
| SCXA (SCX) (NM_00108050514) human tagged ORF clone | OriGene | RC224305L4 | |
| Silicone plates | CellScale | N/A | |
| Sodium azide | Millipore Sigma | S2002 | |
| Tenascin C human Taqman primer | Thermofisher | Hs00370384_m1 | |
| Tenomodulin human Taqman primer | Thermofisher | Hs00223332_m1 | |
| Thrombospondin 4 human Taqman primer | Thermofisher | Hs00170261_m1 | |
| Transfection reagent, BioT | Bioland Scientific LLC | B01-01 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermofisher | 25200072 | |
| Tubulin polymerization promoting protein family member 3 | Thermofisher | Hs03043892_m1 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Biogems | 1293823 |
Riferimenti
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