Denne artikkelen beskriver en prosedyre for å produsere iTenocytter ved å generere iPSC-avledede mesenkymale stromale celler med kombinert overekspresjon av Scleraxis ved hjelp av en lentiviral vektor og uniaxial strekking via en 2D-bioreaktor.
Dagens utfordringer i sene og ligament reparasjon nødvendiggjør identifisering av en egnet og effektiv kandidat for cellebasert terapi for å fremme sene regenerering. Mesenkymale stromale celler (MSC) har blitt utforsket som en potensiell vevsteknisk strategi for senereparasjon. Mens de er multipotente og har regenerativt potensial in vivo, er de begrenset i sin selvfornyelseskapasitet og utviser fenotypisk heterogenitet. Induserte pluripotente stamceller (iPSCs) kan omgå disse begrensningene på grunn av deres høye selvfornyelseskapasitet og uovertruffen utviklingsplastisitet. I tenocyttutvikling er Scleraxis (Scx) en avgjørende direkte molekylær regulator av senedifferensiering. I tillegg har mekanoregulering vist seg å være et sentralt element som styrer embryonal seneutvikling og helbredelse. Som sådan har vi utviklet en protokoll for å innkapsle den synergistiske effekten av biologisk og mekanisk stimulering som kan være avgjørende for å generere tenocytter. iPSCs ble indusert til å bli mesenkymale stromale celler (iMSCs) og ble karakterisert med klassiske mesenkymale stromale cellemarkører via flowcytometri. Deretter ble iMSCene ved hjelp av en lentiviralvektor transdusert til stabilt overuttrykkende SCX (iMSCSCX+). Disse iMSCSCX+ -cellene kan modnes videre til iTenocytter via uniaxial strekkbelastning ved hjelp av en 2D-bioreaktor. De resulterende cellene ble karakterisert ved å observere oppregulering av tidlige og sene senemarkører, samt kollagenavsetning. Denne metoden for å generere iTenocytter kan brukes til å hjelpe forskere med å utvikle en potensielt ubegrenset allogen cellekilde for senecelleterapiapplikasjoner.
For å takle de moderne problemene i sener og ligamentreparasjon, er det et krav om en relevant cellekandidat som er egnet for cellebaserte terapier. En undersøkelsesvei innen vevsteknikk for senereparasjon innebærer utforskning av benmargsavledede mesenkymale stromale celler (BM-MSC) og fettvevsavledede stromale celler (ASC) som potensielle strategier. Disse cellene har multipotent evne, stor overflod og regenerativt potensial in vivo. I tillegg har de vist forbedret helbredelseskapasitet og forbedrede funksjonelle resultater i dyremodeller1. Ikke desto mindre viser disse cellene begrensede selvfornyelsesevner, fenotypisk mangfold og spesielt begrenset kapasitet for senedannelse. Induced pluripotent stem cell (iPSC) teknologi tilbyr en løsning på disse begrensningene på grunn av sin bemerkelsesverdige selvfornyelseskapasitet og uovertruffen utviklingstilpasningsevne. Vårt forskningsteam og andre har oppnådd vellykket differensiering av iPSCs i mesenkymale stromale cellelignende enheter (iMSCs)2,3. Som sådan har iMSCs potensial til å være en allogen kilde for senecelleterapiapplikasjoner.
Sklerakse (SCX) er en transkripsjonsfaktor som er avgjørende for seneutvikling og regnes som den tidligste påvisbare markøren for differensierte tenocytter. I tillegg aktiverer SCX nedstrøms senedifferensieringsmarkører, inkludert type 1a1-kjedekollagen 1 (COL1a1), mohawk (MKX) og tenomodulin (TNMD), blant annet 4,5,6. Andre gener uttrykt under senemodning inkluderer tubulinpolymerisasjonsfremmende proteinfamiliemedlem 3 (TPPP3) og blodplateavledet vekstfaktorreseptor alfa (PDGFRa)7. Selv om disse genene er essensielle for seneutvikling og modning, er de dessverre ikke unike for senevev og uttrykkes i andre muskel- og skjelettvev som bein eller brusk 5,7.
I tillegg til uttrykk av markører under seneutvikling, er mekanostimering et viktig element for embryonal seneutvikling og helbredelse 4,5,6. Sener er mekanoresponsive, og deres vekstmønstre endres som svar på deres miljø. På molekylært nivå påvirker biomekaniske signaler utvikling, modning, vedlikehold og helbredende responser av tenocytter8. Ulike bioreaktorsystemer har blitt brukt til å modellere fysiologiske belastninger og biomekaniske tegn. Noen av disse modellsystemene inkluderer ex vivo vevsbelastning, 2D-cellelastingssystemer som bruker biaksial eller uniaxial spenning, og 3D-systemer ved bruk av stillaser og hydrogeler 9,10. 2D-systemer er fordelaktige når man studerer den mekaniske stimuleringens effekter på enten senespesifikke gener eller morfologien til cellene i sammenheng med celleskjebne, mens 3D-systemer mer nøyaktig kan replikere celle-ECM-interaksjoner 9,10.
I 2D-lastesystemer er belastningen mellom cellene og kultursubstratet homogen, noe som betyr at den påførte belastningen på cytoskjelettet til cellene kan kontrolleres fullt ut. Sammenlignet med biaksial belastning er uniaxial belastning mer fysiologisk relevant, da tenocytter hovedsakelig utsettes for uniaxial belastning fra kollagenbunter in vivo9. Det er funnet at under daglige aktiviteter blir sener utsatt for uniaxial strekkbelastning opp til 6% belastning11. Spesielt har tidligere studier funnet at belastning innenfor de fysiologiske områdene på 4% -5% har vist seg å fremme tenogen differensiering ved å bevare senerelatert markøruttrykk som SCX og TNMD, samt økt kollagenproduksjon 9,10. Stammer på mer enn 10% kan være traumatisk relevante, men ikke fysiologisk relevante12,13.
Her presenteres en protokoll som tar hensyn til den synergistiske effekten av mekanisk og biologisk stimulering som kan være avgjørende for generering av tenocytter. Vi beskriver først en reproduserbar metode for å indusere iPSCs i iMSCs via kortvarig eksponering av embryoidlegemer til vekstfaktorer, bekreftet av MSC-overflatemarkører ved bruk av flowcytometri. Deretter beskriver vi en lentiviral transduksjonsmetode for å konstruere iMSC-er for å ha stabilt overuttrykk av SCX (iMSCSCX+). For videre cellemodning blir iMSCSCX+ sådd til fibronektinbelagte silikonplater og gjennomgår en optimalisert uniaxial spenningsprotokoll ved bruk av CellScale MCFX-bioreaktor. Det tenogene potensialet ble bekreftet ved å observere oppregulering av tidlige og sene senemarkører, samt kollagenavsetning14. Denne metoden for å generere iTenocytter er et proof-of-concept som kan tilby en ubegrenset hyllevare, allogen kilde for senecelleterapiapplikasjoner.
I denne protokollen genereres iTenocytter gjennom tre hovedtrinn: (1) induksjon av iPSCs til iMSCs, (2) overekspresjon av SCX ved hjelp av en lentiviral vektor, og (3) modning av celler gjennom 2D uniaxial spenning.
Protokollen som presenteres for å differensiere iPSCer til iMSC-er er tidligere beskrevet av vår gruppe2. Siden den publikasjonen har mange protokoller blitt utviklet, inkludert en etablert protokoll for bruk av iMSC i kliniske studier 21,22,23, samt komme…
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble delvis støttet av NIH/NIAMS K01AR071512 og CIRM DISC0-14350 til Dmitriy Sheyn. De to lentivirusemballasjeplasmidene var en gave fra Simon Knott-laboratoriet (Institutt for biomedisinsk vitenskap, Cedars-Sinai Medical Center).
2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
Accutase | StemCell Technologies | 7920 | cell dissociation reagent |
Antibiotic-antimycotic solution | Thermofisher | 15240096 | |
Anti-CD105 | Ancell | 326-050 | |
APC mouse anti-human CD44 | BD Biosciences | 559942 | |
APC mouse IgG2 K isotype control | BD Biosciences | 555745 | |
BenchMark fetal bovine serum | GeminiBio | 100-106 | |
Biglycan | Thermofisher | Hs00959143_m1 | |
Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A3733 | |
Collagen type I alpha 1 chain human Taqman primer | Thermofisher | Hs00164004_m1 | |
Collagen type III alpha 1 chain human Taqman primer | Thermofisher | Hs00943809_m1 | |
Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D8418 | |
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Thermofisher | 11054020 | |
Eagle's minimum essential medium (EMEM) | ATCC | 30-2003 | |
Fibronectin bovine plasma | Sigma Aldrich | F1141 | |
FITC mouse anti-human CD90 | BD Biosciences | 555595 | |
Gelatin from porcine skin | Sigma Aldrich | G1890 | |
Goat anti Mouse IgG1-PE | Bio-Rad | STAR117 | |
HEK 293T/17 | ATCC | CRL-11268 | |
IMDM, no phenol red | Thermofisher | 21056023 | |
iPSCs: 83i-cntr-33n1 | Cedars-Sinai iPSC Core Facility | N/A | https://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/ |
Isotype Control Antibody, mouse IgG2a-FITC | Miltenyi Biotec | 130-113-271 | |
KnockOut serum replacement | Thermofisher | 10828010 | |
L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
L-Glutamine | Thermofisher | 2503081 | |
Matrigel | Corning | 354230 | basement membrane matrix |
MechanoCulture FX | CellScale | N/A | stretching apparatus |
MEM non-essential amino acids solution | Thermofisher | 11140050 | |
Mohawk human Taqman primer | Thermofisher | Hs00543190_m1 | |
mTeSR Plus | StemCell Technologies | 100-0276 | |
PBS | Thermofisher | 10010023 | |
Platelet-derived growth factor receptor A human Taqman primer | Thermofisher | Hs00998018_m1 | |
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) | Sigma Aldrich | 192066 | |
Polybrene infection/transfection reagents | Millipore Sigma | TR-1003 | |
Recombinant human TGF-beta 1 protein human Taqman primer | RnD Systems | 240-B | |
Scleraxis human Taqman primer | Thermofisher | Hs03054634_g1 | |
SCXA (SCX) (NM_00108050514) human tagged ORF clone | OriGene | RC224305L4 | |
Silicone plates | CellScale | N/A | |
Sodium azide | Millipore Sigma | S2002 | |
Tenascin C human Taqman primer | Thermofisher | Hs00370384_m1 | |
Tenomodulin human Taqman primer | Thermofisher | Hs00223332_m1 | |
Thrombospondin 4 human Taqman primer | Thermofisher | Hs00170261_m1 | |
Transfection reagent, BioT | Bioland Scientific LLC | B01-01 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermofisher | 25200072 | |
Tubulin polymerization promoting protein family member 3 | Thermofisher | Hs03043892_m1 | |
Y-27632 dihydrochloride | Biogems | 1293823 |