Generación de iTenocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas a través de la sobreexpresión combinada de escleraxis y la tensión uniaxial 2D
Summary
Este artículo describe un procedimiento para producir iTenocitos mediante la generación de células estromales mesenquimales derivadas de iPSC con sobreexpresión combinada de Scleraxis utilizando un vector lentiviral y estiramiento uniaxial a través de un biorreactor 2D.
Abstract
Los desafíos actuales en la reparación de tendones y ligamentos requieren la identificación de un candidato adecuado y eficaz para la terapia basada en células para promover la regeneración de los tendones. Las células estromales mesenquimales (MSC) se han explorado como una posible estrategia de ingeniería de tejidos para la reparación de tendones. Si bien son multipotentes y tienen potencial regenerativo in vivo, están limitados en su capacidad de autorrenovación y exhiben heterogeneidad fenotípica. Las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) pueden eludir estas limitaciones debido a su alta capacidad de autorrenovación y a su plasticidad de desarrollo sin precedentes. En el desarrollo de los tenocitos, la escleraxis (Scx) es un regulador molecular directo crucial de la diferenciación de los tendones. Además, se ha demostrado que la mecanorregulación es un elemento central que guía el desarrollo y la curación de los tendones embrionarios. Como tal, hemos desarrollado un protocolo para encapsular el efecto sinérgico de la estimulación biológica y mecánica que puede ser esencial para la generación de tenocitos. Las iPSC fueron inducidas a convertirse en células estromales mesenquimales (iMSC) y se caracterizaron con marcadores clásicos de células estromales mesenquimales mediante citometría de flujo. A continuación, utilizando un vector lentiviral, las iMSCs se transducieron a una sobreexpresión estable de SCX (iMSCSCX+). Estas célulasiMSC SCX+ pueden madurar aún más en iTenocitos mediante carga de tracción uniaxial utilizando un biorreactor 2D. Las células resultantes se caracterizaron por la observación de la regulación positiva de los marcadores tendinosos tempranos y tardíos, así como la deposición de colágeno. Este método de generación de iTenocitos se puede utilizar para ayudar a los investigadores a desarrollar una fuente celular alogénica potencialmente ilimitada para aplicaciones de terapia celular tendinosa.
Introduction
Para hacer frente a los problemas contemporáneos en la reparación de tendones y ligamentos, se requiere una célula candidata pertinente adecuada para las terapias basadas en células. Una vía de investigación en ingeniería de tejidos para la reparación de tendones implica la exploración de células estromales mesenquimales derivadas de la médula ósea (BM-MSC) y células estromales derivadas del tejido adiposo (ASC) como posibles estrategias. Estas células tienen capacidad multipotente, gran abundancia y potencial regenerativo in vivo. Además, han demostrado una mayor capacidad de curación y mejores resultados funcionales en modelos animales1. No obstante, estas células exhiben capacidades restringidas de autorrenovación, diversidad fenotípica y, en particular, una capacidad limitada para la formación de tendones. La tecnología de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) ofrece una solución a estas limitaciones debido a su notable capacidad de autorrenovación y a su inigualable adaptabilidad al desarrollo. Nuestro equipo de investigación y otros han logrado una diferenciación exitosa de las iPSC en entidades similares a las células estromales mesenquimales (iMSCs)2,3. Como tal, las iMSC tienen el potencial de ser una fuente alogénica para aplicaciones de terapia celular tendinosa.
La escleraxis (SCX) es un factor de transcripción esencial para el desarrollo de los tendones y se considera el marcador detectable más temprano para los tenocitos diferenciados. Además, SCX activa marcadores de diferenciación tendinosa aguas abajo, incluyendo el colágeno de cadena tipo 1a1 1 (COL1a1), mohawk (MKX) y tenomodulina (TNMD), entre otros 4,5,6. Otros genes expresados durante la maduración del tendón incluyen el miembro 3 de la familia de proteínas promotoras de la polimerización de la tubulina (TPPP3) y el receptor alfa del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRa)7. Si bien estos genes son esenciales para el desarrollo y la maduración de los tendones, desafortunadamente no son exclusivos del tejido tendinoso y se expresan en otros tejidos musculoesqueléticos como el hueso o el cartílago 5,7.
Además de la expresión de marcadores durante el desarrollo del tendón, la mecanoestimulación es un elemento esencial para el desarrollo y la cicatrización del tendón embrionario 4,5,6. Los tendones son mecanosensibles y sus patrones de crecimiento cambian en respuesta a su entorno. A nivel molecular, las señales biomecánicas afectan el desarrollo, la maduración, el mantenimiento y las respuestas de curación de los tenocitos8. Se han utilizado varios sistemas de biorreactores para modelar cargas fisiológicas y señales biomecánicas. Algunos de estos sistemas modelo incluyen la carga tisular ex vivo, los sistemas de carga celular 2D que aplican tensión biaxial o uniaxial y los sistemas 3D que utilizan andamios e hidrogeles 9,10. Los sistemas 2D son ventajosos cuando se estudian los efectos de la estimulación mecánica en genes específicos del tendón o en la morfología de las células en el contexto del destino celular, mientras que los sistemas 3D pueden replicar con mayor precisión las interacciones célula-ECM 9,10.
En los sistemas de carga 2D, la tensión entre las células y el sustrato de cultivo es homogénea, lo que significa que la carga aplicada en el citoesqueleto de las células puede controlarse por completo. En comparación con la carga biaxial, la carga uniaxial es fisiológicamente más relevante, ya que los tenocitos están predominantemente sujetos a la carga uniaxial de los haces de colágeno in vivo9. Se encuentra que durante las actividades diarias, los tendones están sometidos a una carga de tracción uniaxial de hasta un 6% de deformación11. Específicamente, estudios previos han encontrado que la carga dentro de los rangos fisiológicos del 4%-5% ha demostrado promover la diferenciación tenogénica al preservar la expresión de marcadores relacionados con tendones como SCX y TNMD, así como el aumento de la producción de colágeno 9,10. Las cepas de más del 10% pueden ser traumáticamente relevantes, pero no fisiológicamente relevantes12,13.
Aquí se presenta un protocolo que tiene en cuenta el efecto sinérgico de la estimulación mecánica y biológica que puede ser esencial para la generación de tenocitos. En primer lugar, describimos un método reproducible para inducir iPSCs en iMSCs a través de la exposición a corto plazo de cuerpos embrioides a factores de crecimiento, confirmado por marcadores de superficie de MSC mediante citometría de flujo. A continuación, detallamos un método de transducción lentiviral para diseñar iMSCs para que tengan una sobreexpresión estable de SCX (iMSCSCX+). Para una mayor maduración celular, los iMSCSCX+ se siembran en placas de silicona recubiertas de fibronectina y se someten a un protocolo de tensión uniaxial optimizado utilizando el biorreactor CellScale MCFX. El potencial tenógeno se confirmó al observar la regulación positiva de los marcadores tendinosos tempranos y tardíos, así como la deposición de colágeno14. Este método de generación de iTenocitos es una prueba de concepto que puede ofrecer una fuente alogénica ilimitada lista para usar para aplicaciones de terapia celular tendinosa.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este protocolo, los iTenocitos se generan a través de tres pasos principales: (1) inducción de iPSCs a iMSCs, (2) sobreexpresión de SCX utilizando un vector lentiviral y (3) maduración de células a través de tensión uniaxial 2D.
El protocolo presentado para diferenciar las iPSCs en iMSCs ha sido descrito previamente por nuestro grupo2. Desde esa publicación, se han desarrollado numerosos protocolos, incluido un protocolo establecido para el uso de iMSC en ens…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue parcialmente apoyado por el NIH/NIAMS K01AR071512 y CIRM DISC0-14350 a Dmitriy Sheyn. Los dos plásmidos de empaquetamiento de lentivirus fueron un regalo del laboratorio Simon Knott (Departamento de Ciencias Biomédicas, Centro Médico Cedars-Sinai).
Materials
| 2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Accutase | StemCell Technologies | 7920 | cell dissociation reagent |
| Antibiotic-antimycotic solution | Thermofisher | 15240096 | |
| Anti-CD105 | Ancell | 326-050 | |
| APC mouse anti-human CD44 | BD Biosciences | 559942 | |
| APC mouse IgG2 K isotype control | BD Biosciences | 555745 | |
| BenchMark fetal bovine serum | GeminiBio | 100-106 | |
| Biglycan | Thermofisher | Hs00959143_m1 | |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A3733 | |
| Collagen type I alpha 1 chain human Taqman primer | Thermofisher | Hs00164004_m1 | |
| Collagen type III alpha 1 chain human Taqman primer | Thermofisher | Hs00943809_m1 | |
| Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D8418 | |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Thermofisher | 11054020 | |
| Eagle's minimum essential medium (EMEM) | ATCC | 30-2003 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma Aldrich | F1141 | |
| FITC mouse anti-human CD90 | BD Biosciences | 555595 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma Aldrich | G1890 | |
| Goat anti Mouse IgG1-PE | Bio-Rad | STAR117 | |
| HEK 293T/17 | ATCC | CRL-11268 | |
| IMDM, no phenol red | Thermofisher | 21056023 | |
| iPSCs: 83i-cntr-33n1 | Cedars-Sinai iPSC Core Facility | N/A | https://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/ |
| Isotype Control Antibody, mouse IgG2a-FITC | Miltenyi Biotec | 130-113-271 | |
| KnockOut serum replacement | Thermofisher | 10828010 | |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
| L-Glutamine | Thermofisher | 2503081 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | basement membrane matrix |
| MechanoCulture FX | CellScale | N/A | stretching apparatus |
| MEM non-essential amino acids solution | Thermofisher | 11140050 | |
| Mohawk human Taqman primer | Thermofisher | Hs00543190_m1 | |
| mTeSR Plus | StemCell Technologies | 100-0276 | |
| PBS | Thermofisher | 10010023 | |
| Platelet-derived growth factor receptor A human Taqman primer | Thermofisher | Hs00998018_m1 | |
| Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) | Sigma Aldrich | 192066 | |
| Polybrene infection/transfection reagents | Millipore Sigma | TR-1003 | |
| Recombinant human TGF-beta 1 protein human Taqman primer | RnD Systems | 240-B | |
| Scleraxis human Taqman primer | Thermofisher | Hs03054634_g1 | |
| SCXA (SCX) (NM_00108050514) human tagged ORF clone | OriGene | RC224305L4 | |
| Silicone plates | CellScale | N/A | |
| Sodium azide | Millipore Sigma | S2002 | |
| Tenascin C human Taqman primer | Thermofisher | Hs00370384_m1 | |
| Tenomodulin human Taqman primer | Thermofisher | Hs00223332_m1 | |
| Thrombospondin 4 human Taqman primer | Thermofisher | Hs00170261_m1 | |
| Transfection reagent, BioT | Bioland Scientific LLC | B01-01 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermofisher | 25200072 | |
| Tubulin polymerization promoting protein family member 3 | Thermofisher | Hs03043892_m1 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Biogems | 1293823 |
Riferimenti
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