Ekstracellulær vesikelvævsfaktoraktivitetsanalyse

Summary

Her beskriver vi en intern ekstracellulær vesikelvævsfaktoraktivitetsanalyse. Aktivitetsbaserede assays og antigenbaserede assays er blevet anvendt til at måle vævsfaktor i ekstracellulære vesikler fra humane plasmaprøver. Aktivitetsbaserede assays har højere følsomhed og specificitet end antigenbaserede assays.

Abstract

Vævsfaktor (TF) er en transmembranreceptor for faktor (F) VII og FVIIa. TF/FVIIa-komplekset initierer koagulationskaskaden ved at aktivere både FIX og FX. TF frigives fra celler til cirkulationen i form af ekstracellulære vesikler (EV’er). Niveauet af TF-positive (⁺) EV’er øges i forskellige sygdomme, herunder kræft, bakterielle og virale infektioner og skrumpelever, og er forbundet med trombose, dissemineret intravaskulær koagulation, sygdommens sværhedsgrad og dødelighed. Der er to måder at måle TF⁺ EV’er i plasma: antigen- og aktivitetsbaserede assays. Data indikerer, at aktivitetsbaserede assays har højere følsomhed og specificitet end antigenbaserede assays. Dette papir beskriver vores interne EVTF-aktivitetsanalyse baseret på et to-trins FXa-generationsassay. FVIIa, FX og calcium tilsættes til TF⁺ EV-holdige prøver for at generere FXa i nærvær og fravær af anti-TF-antistof for at skelne TF-afhængig FXa-generering fra TF-uafhængig FXa-generation. Et kromogent substrat spaltet af FXa anvendes til at bestemme FXa-niveauet, mens en standardkurve genereret med en relipideret rekombinant TF anvendes til bestemmelse af TF-koncentrationen. Denne interne EVTF-aktivitetsanalyse har højere følsomhed og specificitet end et kommercielt TF-aktivitetsassay.

Introduction

Blodkoagulation initieres med binding af faktor (F) VII/VIIa til vævsfaktor (TF)¹. TF / FVIIa-komplekset aktiverer både FIX og FX for at aktivere blodkoagulation¹. Der er to former for membranbundet TF i fuld længde: krypteret og aktiv. Derudover er der en alternativt splejset form af TF (asTF). Sphingomyelin og phosphatidylcholin i cellemembranens ydre folder opretholder TF i krypteret tilstand ^2,3,4. Når celler aktiveres eller beskadiges, overfører phospholipidscramblase phosphatidylserin og andre negativt ladede phospholipider til den ydre folder¹. Aktiveringen af celler resulterer også i translokation af sur sphingomyelinase til den ydre folder, hvor den nedbryder sphingomyelin til ceramid⁵. Disse to mekanismer konverterer krypteret TF til den aktive form. Det foreslås også, at proteindisulfidisomerase medierer disulfidbindingsdannelse mellem Cys186 og Cys209 i krypteret TF, hvilket resulterer i dekryptering af TF ^6,7,8. asTF er også til stede i cirkulationen, men mangler transmembrandomænet og er derfor opløseligt ^9,10. Det er vigtigt, at asTF har meget lave niveauer af prokoagulerende aktivitet sammenlignet med aktiv TF^10,11 i fuld længde.

Ekstracellulære vesikler (EV’er) frigives fra hvilende, aktiverede og døende værtsceller samt kræftceller¹². Elbiler udtrykker proteiner fra deres forældreceller¹². Aktive TF-bærende EV’er frigives fra aktiverede monocytter, endotelceller og tumorceller i cirkulationen 13,14,15. Niveauer af TF i plasma kan måles ved aktivitets- og antigenbaserede assays. Antigenbaserede assays inkluderer ELISA og flowcytometri¹⁶. Der er to forskellige aktivitetsbaserede assays: et- og to-trins TF-aktivitetsassays. Ettrinsanalysen er baseret på et plasmabaseret koagulationsassay. Den TF-holdige prøve tilsættes til plasma, og tiden til dannelse af en koagulation måles efter genforkalkning. To-trins analysen måler FXa-generering af prøver ved at tilføje FVII eller FVIIa, FX og calcium. FXa-niveauer bestemmes ved hjælp af et substrat, der spaltes af FXa.

I både et- og totrins TF-aktivitetsassays bestemmes TF-koncentrationen ved hjælp af en standardkurve genereret med rekombinant TF. To-trins assays har højere følsomhed og specificitet end et-trins assayet. Mange undersøgelser har bekræftet, at aktivitetsbaserede assays har højere følsomhed og specificitet end antigenbaserede assays 17,18,19,20,21. Derudover har vores interne aktivitetsanalyse højere følsomhed og specificitet end et kommercielt aktivitetsassay²². Raske individer har meget lave eller uopdagelige niveauer af EVTF-aktivitet i plasma. I modsætning hertil har personer med patologiske tilstande, såsom kræft, skrumpelever, sepsis og virusinfektion, påviselige niveauer af EVTF-aktivitet, og dette er forbundet med trombose, dissemineret intravaskulær koagulation, sygdomssværhedsgrad og dødelighed 23,24,25,26,27,28. Her vil vi beskrive dette interne to-trins EVTF-aktivitetsassay.

Protocol

Forskningen blev godkendt af Institutional Review Board ved University of North Carolina i Chapel Hill (protokolnummer: 14-2108). 1. Blodindsamling fra donorer Fuldblod opsamles ved hjælp af ren venepunktur i den antecubitale vene med en 21 G nål. Kassér de første 3 ml blod, fordi denne del af blodet kan indeholde TF fra perivaskulære celler. Træk 2,7 eller 1,8 ml (afhængigt af størrelsen af rørene) blod i en vakutainer indeholdende 3,2% natriumcit…

Representative Results

Et vellykket resultat giver en positiv kontrolværdi på ≥0,5 pg/ml og en negativ kontrolværdi på 1,0 pg/ml EVTF-aktivitet for en positiv kontrol. Det repræsentative resultat viser EVTF-aktiviteten af EV’er isoleret fra plasma fra fuldblod fra 11 raske donorer, med og uden LPS-aktivering (figur 4). Seks ud af elleve donorer (donor 2, 4, 5, 8, 10, 11) var mellemstore til høje LPS-respondenter, mens fem ud af elleve donorer (do…

Discussion

Her præsenteres protokollen for vores interne EVTF-aktivitetsanalyse. Der er tre kritiske trin i protokollen. Ved rekonstituering af EV-pillen er det vigtigt at pipette op og ned på EV-pelletens placering, selvom den ikke er synlig. Ufuldstændig rekonstitution af EV-pelleten vil resultere i en falsk negativ eller undervurdering af EVTF-aktivitetsværdier for prøverne. For det andet er brug af HBSA-Ca (+) kritisk i protokoltrin 6.5, fordi FXa-generering ikke kan genereres uden calcium. For det tredje er det afgørende…

Materials

1.5 mL tube for 20,000 x g centrifuge	any company	N/A	We use the one from Fisher Scientific (Catalog number: 05-408-129).
1.5 mL tube for ultracentrifuge	any company	N/A	We use the one from Beckman Coulter (Catalog number: 357448)
15 mL tube	any company	N/A	We use the one from VWR (Catalog number: 89039-666)
21 G x .75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set with 12 in. tubing and luer adapter	BD	367281
96-well plate	any company	N/A	We use the one from Globe Scientific (Catalog number: 120338).
BD Vacutainer Citrate Tubes	BD	363083
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A9418
Calcium chloride	Fisher Scientific	C69-500
Centrifuge for 1.5 mL tube	any company	N/A	We use the Centrifuge 5417R (Eppendorf).
Centrifuge for 15 mL tube	any company	N/A	We use the Centrifuge 5810R (Eppendorf).
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich	G7021
Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate	Sigma Aldrich	E6511
Hepes	Sigma Aldrich	H4034
Human FVIIa	Enzyme Research Laboratory	HFVIIa	The solution should be diluted with HBSA-Ca(+).
Human FX	Enzyme Research Laboratory	HFX1010	The solution should be diluted with HBSA-Ca(+).
Inhibitory mouse anti-human tissue factor IgG, clone HTF-1	Fisher Scientific	550252
Lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4	Sigma Aldrich	L2630	There are several lipopolysaccharide from different E. coli. Different lipopolysaccharide have different potential to activate monocytes.
Mouse IgG	Sigma Aldrich	I5381
Pefachrome FXa 8595	Enzyme Research Laboratory	085-27
Plate reader	any company	N/A	We use the SpectraMax i3x from Molecular Devices
Re-lipidated recombinant tissue factor, Dade Innovin	Siemens	10873566
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-500
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima TLX
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	TLA-55