Extracellulaire vesikel weefselfactoractiviteitstest
Summary
Hier beschrijven we een in-house extracellulaire vesikel weefselfactoractiviteitstest. Op activiteit gebaseerde assays en op antigeen gebaseerde assays zijn gebruikt om de weefselfactor te meten in extracellulaire blaasjes van menselijke plasmamonsters. Op activiteit gebaseerde assays hebben een hogere gevoeligheid en specificiteit dan op antigeen gebaseerde assays.
Abstract
Weefselfactor (TF) is een transmembraanreceptor voor factor (F) VII en FVIIa. Het TF/FVIIa-complex initieert de stollingscascade door zowel FIX als FX te activeren. TF komt vrij uit cellen in de bloedsomloop in de vorm van extracellulaire blaasjes (EV’s). Het niveau van TF-positieve (+) EV’s is verhoogd bij verschillende ziekten, waaronder kanker, bacteriële en virale infecties en cirrose, en wordt geassocieerd met trombose, gedissemineerde intravasculaire coagulatie, ernst van de ziekte en mortaliteit. Er zijn twee manieren om TF+ EV’s in plasma te meten: antigeen- en activiteitsgebaseerde assays. Gegevens geven aan dat op activiteit gebaseerde assays een hogere gevoeligheid en specificiteit hebben dan op antigeen gebaseerde assays. Dit artikel beschrijft onze interne EVTF-activiteitstest op basis van een tweetraps FXa-generatietest. FVIIa, FX en calcium worden toegevoegd aan de TF+ EV-bevattende monsters om FXa te genereren in de aan- en afwezigheid van anti-TF-antilichamen om TF-afhankelijke FXa-generatie te onderscheiden van TF-onafhankelijke FXa-generatie. Een chromogeen substraat dat door FXa wordt gesplitst, wordt gebruikt om het FXa-niveau te bepalen, terwijl een standaardcurve gegenereerd met een gerelipideerde recombinante TF wordt gebruikt voor de bepaling van de TF-concentratie. Deze interne EVTF-activiteitstest heeft een hogere gevoeligheid en specificiteit dan een commerciële TF-activiteitstest.
Introduction
De bloedstolling wordt geïnitieerd met de binding van factor (F) VII/VIIa aan weefselfactor (TF)1. Het TF/FVIIa-complex activeert zowel FIX als FX om de bloedstolling te activeren1. Er zijn twee vormen van membraangebonden TF over de volledige lengte: versleuteld en actief. Daarnaast is er een alternatief gesplitste vorm van TF (asTF). Sfingomyeline en fosfatidylcholine in het buitenste blad van het celmembraan houden TF in een gecodeerde toestand 2,3,4. Wanneer cellen worden geactiveerd of beschadigd, brengt fosfolipide-scramblase fosfatidylserine en andere negatief geladen fosfolipiden over naar de buitenste blaadje1. De activering van cellen resulteert ook in de translocatie van zuur sfingomyelinase naar de buitenste blaad, waar het sfingomyeline afbreekt tot ceramide5. Deze twee mechanismen zetten versleutelde TF om in de actieve vorm. Er wordt ook voorgesteld dat eiwitdisulfide-isomerase de vorming van disulfidebindingen tussen Cys186 en Cys209 in gecodeerde TF bemiddelt, wat resulteert in de de-encryptie van TF 6,7,8. asTF is ook aanwezig in de bloedsomloop, maar mist het transmembraandomein en is daarom oplosbaar 9,10. Belangrijk is dat asTF zeer lage niveaus van procoagulantia-activiteit heeft in vergelijking met actieve TF10,11 over de volledige lengte.
Extracellulaire blaasjes (EV’s) komen vrij uit rustende, geactiveerde en stervende gastheercellen, evenals kankercellen12. EV’s brengen eiwitten tot expressie uit hun oudercellen12. Actieve TF-dragende EV’s komen vrij uit geactiveerde monocyten, endotheelcellen en tumorcellen in de bloedsomloop 13,14,15. Niveaus van TF in plasma kunnen worden gemeten door middel van activiteits- en antigeengebaseerde assays. Op antigeen gebaseerde assays omvatten ELISA en flowcytometrie16. Er zijn twee verschillende op activiteit gebaseerde tests: één- en tweetraps TF-activiteitstests. De eentrapstest is gebaseerd op een op plasma gebaseerde stollingstest. Het TF-bevattende monster wordt aan plasma toegevoegd en de tijd om een stolsel te vormen wordt gemeten na herverkalking. De tweetrapstest meet FXa-generatie van monsters door FVII of FVIIa, FX en calcium toe te voegen. FXa-niveaus worden bepaald met behulp van een substraat dat door FXa wordt gesplitst.
In zowel de een- als de tweetraps TF-activiteitsassays wordt de TF-concentratie bepaald met behulp van een standaardcurve die wordt gegenereerd met recombinant TF. Tweetrapstesten hebben een hogere sensitiviteit en specificiteit dan de eentrapstest. Veel onderzoeken hebben bevestigd dat op activiteit gebaseerde assays een hogere gevoeligheid en specificiteit hebben dan op antigeen gebaseerde assays 17,18,19,20,21. Bovendien heeft onze interne activiteitstest een hogere sensitiviteit en specificiteit dan een commerciële activiteitstest22. Gezonde personen hebben zeer lage of niet-detecteerbare niveaus van EVTF-activiteit in plasma. Daarentegen hebben personen met pathologische aandoeningen, zoals kanker, cirrose, sepsis en virale infectie, detecteerbare niveaus van EVTF-activiteit en dit wordt geassocieerd met trombose, gedissemineerde intravasculaire coagulatie, ernst van de ziekte en mortaliteit 23,24,25,26,27,28. Hier zullen we deze interne tweetraps EVTF-activiteitstest beschrijven.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier wordt het protocol van onze interne EVTF-activiteitstest gepresenteerd. Er zijn drie cruciale stappen in het protocol. Bij het reconstitueren van de EV-pellet is het belangrijk om op en neer te pipetten op de plaats van de EV-pellet, zelfs als deze niet zichtbaar is. Onvolledige reconstitutie van de EV-pellet zal resulteren in een vals-negatief of onderschatting van de EVTF-activiteitswaarden van de monsters. Ten tweede is het gebruik van HBSA-Ca(+) van cruciaal belang in protocolstap 6.5, omdat FXa-generatie niet k…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de NIH NHLBI R35HL155657 (N.M.) en het John C. Parker professorship (N.M.). We willen mevrouw Sierra J. Archibald bedanken voor haar nuttige opmerkingen
Materials
| 1.5 mL tube for 20,000 x g centrifuge | any company | N/A | We use the one from Fisher Scientific (Catalog number: 05-408-129). |
| 1.5 mL tube for ultracentrifuge | any company | N/A | We use the one from Beckman Coulter (Catalog number: 357448) |
| 15 mL tube | any company | N/A | We use the one from VWR (Catalog number: 89039-666) |
| 21 G x .75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set with 12 in. tubing and luer adapter | BD | 367281 | |
| 96-well plate | any company | N/A | We use the one from Globe Scientific (Catalog number: 120338). |
| BD Vacutainer Citrate Tubes | BD | 363083 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C69-500 | |
| Centrifuge for 1.5 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5417R (Eppendorf). |
| Centrifuge for 15 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5810R (Eppendorf). |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate | Sigma Aldrich | E6511 | |
| Hepes | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Human FVIIa | Enzyme Research Laboratory | HFVIIa | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
| Human FX | Enzyme Research Laboratory | HFX1010 | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
| Inhibitory mouse anti-human tissue factor IgG, clone HTF-1 | Fisher Scientific | 550252 | |
| Lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4 | Sigma Aldrich | L2630 | There are several lipopolysaccharide from different E. coli. Different lipopolysaccharide have different potential to activate monocytes. |
| Mouse IgG | Sigma Aldrich | I5381 | |
| Pefachrome FXa 8595 | Enzyme Research Laboratory | 085-27 | |
| Plate reader | any company | N/A | We use the SpectraMax i3x from Molecular Devices |
| Re-lipidated recombinant tissue factor, Dade Innovin | Siemens | 10873566 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima TLX | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | TLA-55 |
Riferimenti
- Grover, S. P., Mackman, N. Tissue factor: an essential mediator of hemostasis and trigger of thrombosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (4), 709-725 (2018).
- Shaw, A. W., Pureza, V. S., Sligar, S. G., Morrissey, J. H. The local phospholipid environment modulates the activation of blood clotting. Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6556-6563 (2007).
- Tavoosi, N., et al. Molecular determinants of phospholipid synergy in blood clotting. Journal of Biological Chemistry. 286 (26), 23247-23253 (2011).
- Wang, J., Pendurthi, U. R., Rao, L. V. M. Sphingomyelin encrypts tissue factor: ATP-induced activation of A-SMase leads to tissue factor decryption and microvesicle shedding. Blood Advances. 1 (13), 849-862 (2017).
- Kornhuber, J., Rhein, C., Muller, C. P., Muhle, C. Secretory sphingomyelinase in health and disease. Biological Chemistry. 396 (6-7), 707-736 (2015).
- Versteeg, H. H., Ruf, W. Tissue factor coagulant function is enhanced by protein-disulfide isomerase independent of oxidoreductase activity. Journal of Biological Chemistry. 282 (35), 25416-25424 (2007).
- Reinhardt, C., et al. Protein disulfide isomerase acts as an injury response signal that enhances fibrin generation via tissue factor activation. Journal of Clinical Investigation. 118 (3), 1110-1122 (2008).
- Langer, F., et al. Rapid activation of monocyte tissue factor by antithymocyte globulin is dependent on complement and protein disulfide isomerase. Blood. 121 (12), 2324-2335 (2013).
- Bogdanov, V. Y., et al. Alternatively spliced human tissue factor: a circulating, soluble, thrombogenic protein. Nature Medicine. 9 (4), 458-462 (2003).
- Mackman, N. Alternatively spliced tissue factor – one cut too many. Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 5-8 (2007).
- Censarek, P., Bobbe, A., Grandoch, M., Schror, K., Weber, A. A. Alternatively spliced human tissue factor (asHTF) is not pro-coagulant. Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 11-14 (2007).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Osterud, B., Bjorklid, E. Tissue factor in blood cells and endothelial cells. Frontiers in Bioscience (Elite Edition). 4 (1), 289-299 (2012).
- Hisada, Y., Mackman, N. Cancer cell-derived tissue factor-positive extracellular vesicles: biomarkers of thrombosis and survival. Current Opinion in Hematology. 26 (5), 349-356 (2019).
- Vatsyayan, R., Kothari, H., Pendurthi, U. R., Rao, L. V. 4-Hydroxy-2-nonenal enhances tissue factor activity in human monocytic cells via p38 mitogen-activated protein kinase activation-dependent phosphatidylserine exposure. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (7), 1601-1611 (2013).
- Mackman, N., Sachetto, A. T. A., Hisada, Y. Measurement of tissue factor-positive extracellular vesicles in plasma: strengths and weaknesses of current methods. Current Opinion in Hematology. 29 (5), 266-274 (2022).
- Lee, R. D., et al. Pre-analytical and analytical variables affecting the measurement of plasma-derived microparticle tissue factor activity. Thrombosis Research. 129 (1), 80-85 (2012).
- Claussen, C., et al. Microvesicle-associated tissue factor procoagulant activity for the preoperative diagnosis of ovarian cancer. Thrombosis Research. 141, 39-48 (2016).
- Mackman, N., Hisada, Y., Archibald, S. J., et al. Tissue factor and its procoagulant activity on cancer-associated thromboembolism in pancreatic cancer: Comment by Mackman et al. Cancer Science. 113 (5), 1885-1887 (2022).
- Sachetto, A. T. A., et al. Evaluation of four commercial ELISAs to measure tissue factor in human plasma. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 7 (3), 100133 (2023).
- Archibald, S. J., Hisada, Y., Bae-Jump, V. L., Mackman, N. Evaluation of a new bead-based assay to measure levels of human tissue factor antigen in extracellular vesicles in plasma. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 6 (2), e12677 (2022).
- Tatsumi, K., et al. Evaluation of a new commercial assay to measure microparticle tissue factor activity in plasma: communication from the SSC of the ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (11), 1932-1934 (2014).
- Hisada, Y., et al. Measurement of microparticle tissue factor activity in clinical samples: A summary of two tissue factor-dependent FXa generation assays. Thrombosis Research. 139, 90-97 (2016).
- Tatsumi, K., Hisada, Y., Connolly, A. F., Buranda, T., Mackman, N. Patients with severe orthohantavirus cardiopulmonary syndrome due to Sin Nombre Virus infection have increased circulating extracellular vesicle tissue factor and an activated coagulation system. Thrombosis Research. 179, 31-33 (2019).
- Schmedes, C. M., et al. Circulating Extracellular Vesicle Tissue Factor Activity During Orthohantavirus Infection Is Associated With Intravascular Coagulation. Journal of Infectious Diseases. 222 (8), 1392-1399 (2020).
- Rosell, A., et al. Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-Brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).
- Campbell, R. A., et al. Comparison of the coagulopathies associated with COVID-19 and sepsis. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 5 (4), e12525 (2021).
- Guervilly, C., et al. Dissemination of extreme levels of extracellular vesicles: tissue factor activity in patients with severe COVID-19. Blood Advances. 5 (3), 628-634 (2021).
- Hisada, Y., Mackman, N. Measurement of tissue factor activity in extracellular vesicles from human plasma samples. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 3 (1), 44-48 (2019).
- Sachetto, A. T. A., et al. Tissue factor activity of small and large extracellular vesicles in different diseases. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 7 (3), 100124 (2023).
- Bom, V. J., Bertina, R. M. The contributions of Ca2+, phospholipids and tissue-factor apoprotein to the activation of human blood-coagulation factor X by activated factor VII. Biochemical Journal. 265 (2), 327-336 (1990).
- Tilley, R. E., Holscher, T., Belani, R., Nieva, J., Mackman, N. Tissue factor activity is increased in a combined platelet and microparticle sample from cancer patients. Thrombosis Research. 122 (5), 604-609 (2008).
- Gurung, S., Perocheau, D., Touramanidou, L., Baruteau, J. The exosome journey: from biogenesis to uptake and intracellular signalling. Cell Communication and Signaling. 19 (1), 47 (2021).
- Garnier, D., et al. Cancer cells induced to express mesenchymal phenotype release exosome-like extracellular vesicles carrying tissue factor. Journal of Biological Chemistry. 287 (52), 43565-43572 (2012).
- Park, J. A., et al. Tissue factor-bearing exosome secretion from human mechanically stimulated bronchial epithelial cells in vitro and in vivo. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 130 (6), 1375-1383 (2012).
