Ensayo de actividad del factor tisular de vesículas extracelulares
Summary
Aquí describimos un ensayo interno de actividad del factor tisular de vesículas extracelulares. Se han utilizado ensayos basados en la actividad y ensayos basados en antígenos para medir el factor tisular en vesículas extracelulares a partir de muestras de plasma humano. Los ensayos basados en la actividad tienen una mayor sensibilidad y especificidad que los ensayos basados en antígenos.
Abstract
El factor tisular (TF) es un receptor transmembrana del factor (F) VII y FVIIa. El complejo TF/FVIIa inicia la cascada de la coagulación activando tanto FIX como FX. El TF se libera de las células a la circulación en forma de vesículas extracelulares (VE). El nivel de VE TF positivo (+) está aumentado en diversas enfermedades, como el cáncer, las infecciones bacterianas y virales y la cirrosis, y se asocia con trombosis, coagulación intravascular diseminada, gravedad de la enfermedad y mortalidad. Hay dos formas de medir los VE de TF+ en plasma: ensayos basados en antígenos y en actividades. Los datos indican que los ensayos basados en la actividad tienen una mayor sensibilidad y especificidad que los ensayos basados en antígenos. Este artículo describe nuestro ensayo interno de actividad EVTF basado en un ensayo de generación de FXa en dos etapas. FVIIa, FX y calcio se agregan a las muestras que contienen TF+ EV para generar FXa en presencia y ausencia de anticuerpos anti-TF para distinguir la generación de FXa dependiente de TF de la generación de FXa independiente de TF. Para determinar el nivel de FXa se utiliza un sustrato cromogénico escindido por FXa, mientras que para la determinación de la concentración de TF se utiliza una curva estándar generada con un TF recombinante relipidado. Este ensayo de actividad EVTF interno tiene una mayor sensibilidad y especificidad que un ensayo de actividad TF comercial.
Introduction
La coagulación sanguínea se inicia con la unión del factor (F) VII/VIIa al factor tisular (TF)1. El complejo TF/FVIIa activa tanto FIX como FX para activar la coagulación sanguínea1. Hay dos formas de TF de longitud completa unida a la membrana: encriptada y activa. Además, existe una forma alternativa de TF empalmada (asTF). La esfingomielina y la fosfatidilcolina en la valva externa de la membrana celular mantienen el TF en un estado encriptado 2,3,4. Cuando las células se activan o se dañan, la fosfolípido scramblasa transfiere fosfatidilserina y otros fosfolípidos cargados negativamente a la valvaexterna 1. La activación de las células también da lugar a la translocación de la esfingomielinasa ácida a la valva externa, donde degrada la esfingomielina a ceramida5. Estos dos mecanismos convierten TF encriptado en la forma activa. También se propone que la proteína disulfuro isomerasa media la formación de enlaces disulfuro entre Cys186 y Cys209 en TF cifrado, lo que resulta en el descifrado de TF 6,7,8. asTF también está presente en la circulación, pero carece del dominio transmembrana y, por lo tanto, es soluble 9,10. Es importante destacar que el TF tiene niveles muy bajos de actividad procoagulante en comparación con el TF activo de longitud completa10,11.
Las vesículas extracelulares (VE) se liberan de las células huésped en reposo, activadas y moribundas, así como de las células cancerosas12. Los VE expresan proteínas de sus células parentales12. Los VE activos portadores de TF se liberan de los monocitos activados, las células endoteliales y las células tumorales a la circulación 13,14,15. Los niveles de TF en plasma pueden medirse mediante ensayos basados en la actividad y en el antígeno. Los ensayos basados en antígenos incluyen ELISA y citometría de flujo16. Hay dos ensayos diferentes basados en la actividad: ensayos de actividad TF de una y dos etapas. El ensayo de una etapa se basa en un ensayo de coagulación basado en plasma. La muestra que contiene TF se añade al plasma y se mide el tiempo necesario para formar un coágulo después de la recalcificación. El ensayo de dos etapas mide la generación de muestras de FXa mediante la adición de FVII o FVIIa, FX y calcio. Los niveles de FXa se determinan utilizando un sustrato que es escindido por FXa.
Tanto en los ensayos de actividad de TF de una como de dos etapas, la concentración de TF se determina mediante una curva estándar generada con TF recombinante. Los ensayos de dos etapas tienen mayor sensibilidad y especificidad que los ensayos de una etapa. Muchos estudios han confirmado que los ensayos basados en la actividad tienen mayor sensibilidad y especificidad que los ensayos basados en antígenos 17,18,19,20,21. Además, nuestro ensayo de actividad interno tiene una mayor sensibilidad y especificidad que un ensayo de actividad comercial22. Los individuos sanos tienen niveles muy bajos o indetectables de actividad EVTF en plasma. Por el contrario, los individuos con condiciones patológicas, como cáncer, cirrosis, sepsis e infección viral, tienen niveles detectables de actividad EVTF y esto se asocia con trombosis, coagulación intravascular diseminada, gravedad de la enfermedad y mortalidad 23,24,25,26,27,28. Aquí, describiremos este ensayo interno de actividad EVTF de dos etapas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, se presenta el protocolo de nuestro ensayo de actividad EVTF interno. Hay tres pasos críticos en el protocolo. Al reconstituir el gránulo EV, es importante pipetear hacia arriba y hacia abajo en la ubicación del gránulo EV, incluso si no es visible. La reconstitución incompleta del gránulo de EV dará lugar a un falso negativo o a una subestimación de los valores de actividad de EVTF de las muestras. En segundo lugar, el uso de HBSA-Ca(+) es fundamental en el paso 6.5 del protocolo porque la generación de …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el NIH NHLBI R35HL155657 (Nuevo México) y la cátedra John C. Parker (Nuevo México). Nos gustaría agradecer a la Sra. Sierra J. Archibald por sus útiles comentarios
Materials
| 1.5 mL tube for 20,000 x g centrifuge | any company | N/A | We use the one from Fisher Scientific (Catalog number: 05-408-129). |
| 1.5 mL tube for ultracentrifuge | any company | N/A | We use the one from Beckman Coulter (Catalog number: 357448) |
| 15 mL tube | any company | N/A | We use the one from VWR (Catalog number: 89039-666) |
| 21 G x .75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set with 12 in. tubing and luer adapter | BD | 367281 | |
| 96-well plate | any company | N/A | We use the one from Globe Scientific (Catalog number: 120338). |
| BD Vacutainer Citrate Tubes | BD | 363083 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C69-500 | |
| Centrifuge for 1.5 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5417R (Eppendorf). |
| Centrifuge for 15 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5810R (Eppendorf). |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate | Sigma Aldrich | E6511 | |
| Hepes | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Human FVIIa | Enzyme Research Laboratory | HFVIIa | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
| Human FX | Enzyme Research Laboratory | HFX1010 | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
| Inhibitory mouse anti-human tissue factor IgG, clone HTF-1 | Fisher Scientific | 550252 | |
| Lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4 | Sigma Aldrich | L2630 | There are several lipopolysaccharide from different E. coli. Different lipopolysaccharide have different potential to activate monocytes. |
| Mouse IgG | Sigma Aldrich | I5381 | |
| Pefachrome FXa 8595 | Enzyme Research Laboratory | 085-27 | |
| Plate reader | any company | N/A | We use the SpectraMax i3x from Molecular Devices |
| Re-lipidated recombinant tissue factor, Dade Innovin | Siemens | 10873566 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima TLX | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | TLA-55 |
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