Descriviamo un protocollo dettagliato per la preparazione di cellule progenitrici fotorecettrici derivate da hESC post-crioconservate e la somministrazione sub-retinica di queste cellule in topi rd10 .
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Articolo metodologico
Somministrazione sottoretinica di progenitori di fotorecettori derivati da cellule staminali embrionali umane in topi rd10
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La rigenerazione di cellule fotorecettrici utilizzando cellule staminali pluripotenti umane è una terapia promettente per il trattamento di malattie retiniche ereditarie e di invecchiamento in fase avanzata. Abbiamo dimostrato che la matrice isoforme di laminina retina-specifica ricombinante umana è in grado di supportare la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane (hESC) in progenitori dei fotorecettori. Inoltre, l'iniezione sottoretinica di queste cellule ha anche mostrato un ripristino parziale nei modelli di roditore e coniglio rd10 . L'iniezione sottoretinica è nota per essere un metodo consolidato che è stato utilizzato per fornire composti farmaceutici alle cellule fotorecettrici e allo strato epiteliale pigmentato retinico (RPE) dell'occhio a causa della sua vicinanza allo spazio bersaglio. È stato anche utilizzato per fornire vettori virali adeno-associati nello spazio sottoretinico per trattare le malattie della retina. La somministrazione sottoretinica di composti farmaceutici e cellule nel modello murino è impegnativa a causa del vincolo delle dimensioni del bulbo oculare murino. Questo protocollo descrive la procedura dettagliata per la preparazione di cellule progenitrici fotorecettrici derivate da hESC per l'iniezione e la tecnica di somministrazione sottoretinica di queste cellule in topi mutanti genetici di retinite pigmentosa, rd10. Questo approccio consente la terapia cellulare nell'area bersaglio, in particolare lo strato nucleare esterno della retina, dove si verificano malattie che portano alla degenerazione dei fotorecettori.
Introduzione
Le malattie ereditarie della retina e la degenerazione maculare legata all'età portano alla perdita di cellule fotorecettrici e alla cecità. Il fotorecettore retinico è lo strato del segmento esterno della retina composto da cellule specializzate responsabili della fototrasduzione (cioè la conversione della luce in segnali neuronali). Le cellule fotorecettrici dei coni e dei bastoncelli sono adiacenti allo strato pigmentato retinico (RPE)1. La terapia sostitutiva cellulare con fotorecettori per compensare la perdita cellulare è stato un approccio terapeutico emergente e in via di sviluppo. Le cellule staminali embrionali (ESCs....
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Protocollo
Gli esperimenti in vivo sono stati condotti in conformità con le linee guida e il protocollo approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee of SingHealth (IACUC) e dalla Dichiarazione dell'Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) per l'uso di animali nella ricerca oftalmica e sulla visione. I cuccioli sono stati immunodepressi da P17 (pre-trapianto) a P30 (post-trapianto) nutrendoli con acqua potabile contenente ciclosporina (260 g/L).
1. Preparazione dei progenitori dei fotorecettori derivati da hESC del giorno 32 dopo crioconservazione
- Mezzo di differenziazione dei fotorec....
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Risultati
La siringa di vetro da 10 μL è stata assemblata secondo le istruzioni del produttore (Figura 1) e l'ago smussato utilizzato per erogare la sospensione/il terreno cellulare è mostrato nella Figura 1B. I diversi approcci per l'iniezione sottoretinica sono illustrati nella Figura 2. Descriviamo l'approccio pars plana in questo protocollo (Figura 2C). L'ago smussato montato su una siringa di vetro è stato i.......
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Discussione
L'iniezione sottoretinica è stata utilizzata per il trapianto di sospensione cellulare per il trattamento di RPE e malattie retiniche 23,25,26,27,28,31,40. Questo approccio è molto essenziale negli studi sui roditori non solo per il trapianto di cellule e gli approcci di terapia genica, ma a.......
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Dichiarazioni
Hwee Goon Tay è co-fondatore di Alder Therapeutics AB. Altri autori dichiarano di non avere interessi contrastanti.
Ringraziamenti
Ringraziamo Wei Sheng Tan, Luanne Chiang Xue Yen, Xinyi Lee e Yingying Chung per aver fornito assistenza tecnica per la preparazione dei progenitori dei fotorecettori derivati da hESC del giorno 32 dopo la crioconservazione. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalle sovvenzioni del National Medical Research Council Young Investigator Research Grant Award (NMRC/OFYIRG/0042/2017) e dalla National Research Foundation24th Competitive Research Program Grant (CRP24-2020-0083) a H.G.T.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,3% Tobramicina | Novartis | NDC 0078-0813-01 | Tobrex (3,5 g) |
| 0,3% Tobramicina e 0,1% Desametasone | Novartis | NDC 0078-0876-01 | Tobradex (3,5 g) |
| 0,5% Proparacaina cloridrato | Alcon | NDC 0998-0016-15 | 0,5% Alcaine (15 mL) |
| 1 mL Siringa per tubercolina | Turemo | SS01T2713 | |
| 1% Tropicamide | Alcon | NDC 0998-0355-15 | 1% Mydriacyl (15 mL) |
| 2,5% Fenilefrina cloridrato | Alcon | NDC 0998-0342-05 | 2,5% Mydfrin (5 mL) |
| Piastra per coltura tissutale a 24 pozzetti | Costar | 3526 | |
| 30 G Ago monouso | Becton Dickinson (BD) | 305128 | |
| 33 G, 20 mm di lunghezza aghi smussati | Hamilton | 7803-05 | |
| Contatore di cellule automatizzato | NanoEnTek | Modello: Eve | |
| B27 senza vitamina A | Life Technologies | 12587001 | 2%36 |
| Buprenorfina | Ceva | Vetergesic vet (0,3 mg/mL) | |
| CKI-7 | Sigma | C0742 | 5 &; M36 |
| Ciclosporina | Novartis | 260 g/L in acqua potabile | |
| Giorno 32 cellule progenitrici dei fotorecettori derivate da hESC | DUKE-NUS-US Medical School | Le cellule staminali embrionali umane sono differenziate per 32 giorni. Vedi protocollo in Rif. 36. | |
| Vincitore della garza | Industries Co., Ltd. | 1SNW475-4 | |
| Glasgow Minimo Essenziale Medio | Gibco | 11710– 035 | |
| linea cellulare hESC H1 | WiCell Research Institute | WA01 | |
| Fattore neurotrofico derivato dal cervello umano (BDNF) | Peprotech | 450-02-50 | 10 ng/mL36 |
| Fattore neurotrofico ciliare umano (CNTF) | Prospec-Tany Technogene | CYT-272 | 10 ng/mL36 |
| Ketamina cloridrato (100 mg/mL) | Ceva Santé Animale | KETALAB03 | |
| LN-521 | Biolamina | LN521-02 | 1 µ g36 |
| mFreSR | STEMCELL Technologies | 5854 | |
| Siringa in vetro per microlitri (10 mL) | Hamilton | 7653-01 | |
| N-[N-(3,5-difluorofenacetil-L-alanil)]-S-fenilglicina t-butil estere (DAPT) | Selleckchem | S2215 | 10 &; Integratore M36 |
| N-2 | Life Technologies | A13707-01 | 1%36 |
| Aminoacidi non essenziali (NEAA) | Gibco | 11140– 050 | 1x36 |
| NutriStem XF Media | Satorius | 05-100-1A | |
| Microscopio operatorio | Zeiss | OPMI LUMERA 700 | Con funzione iOCT integrata |
| PRDM (Mezzo di differenziazione dei fotorecettori, 50ml) | DUKE-NUS Medical School | Vedi composizione dei supporti36. Medio basale, 10 & micro; M DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0,5 µ M Acido retinoico, 2% B27 e 1% N2. Terreno basale: 1x GMEM, 1 mM di piruvato di sodio, 0,1 mM di B-mercaptoetanolo, 1x aminoacidi non essenziali (NEAA). | |
| Piruvato | Gibco | 11360– 070 | 1 mM36 |
| Rd10 topi | Jackson Laboratory | B6. Topi CXB1-Pde6brd10/J | Sesso: maschio/femmina, Età: P20 (iniezione), Peso: 3-6 g |
| Acido retinoico | Tocris Bioscience | 0695/50 | 0,5 µ M36 |
| Coprioggetto rotondo (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| SB431542 | Sigma | S4317 | 0.5 &; M36 |
| Vidisic Gel (10 g) | Dr. Gerhard Mann Xilazina | ||
| cloridrato (20 mg/mL) | Troy Laboratories | LI0605 | |
| β-mercaptoetanolo | Life Technologies | 21985– 023 | 0,1 mM36 |
Riferimenti
- Molday, R. S., Moritz, O. L. Photoreceptors at a glance. Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).
- Aboualizadeh, E., et al. Imaging Transplanted Photoreceptors in Living Nonhuman Primates with Single-Cell Resolution. Stem Cell Reports. 15
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Ristampe e permessi
