Descrevemos um protocolo detalhado para a preparação de células progenitoras fotorreceptoras derivadas de hESC pós-criopreservadas e a liberação sub-retiniana dessas células em camundongos rd10 .
A regeneração de células fotorreceptoras utilizando células-tronco pluripotentes humanas é uma terapia promissora para o tratamento de doenças retinianas hereditárias e envelhecidas em estágios avançados. Mostramos que a matriz isoforme de laminina recombinante específica da retina humana é capaz de apoiar a diferenciação de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) em progenitores fotorreceptores. Além disso, a injeção sub-retiniana dessas células também mostrou restauração parcial nos modelos rd10 de roedores e coelhos. A injeção sub-retiniana é conhecida por ser um método estabelecido que tem sido usado para entregar compostos farmacêuticos às células fotorreceptoras e à camada epitelial pigmentada da retina (EPR) do olho devido à sua proximidade com o espaço alvo. Ele também tem sido usado para entregar vetores virais adenoassociados no espaço sub-retiniano para tratar doenças da retina. A entrega sub-retiniana de compostos farmacêuticos e células no modelo murino é desafiadora devido à restrição no tamanho do globo ocular murino. Este protocolo descreve o procedimento detalhado para a preparação de células progenitoras fotorreceptoras derivadas de hESC para injeção e a técnica de liberação sub-retiniana dessas células em camundongos mutantes genéticos da retinose pigmentosa, rd10. Esta abordagem permite a terapia celular para a área alvo, em particular a camada nuclear externa da retina, onde ocorrem doenças que levam à degeneração dos fotorreceptores.
Doenças hereditárias da retina e degeneração macular relacionada à idade levam à perda de células fotorreceptoras e eventual cegueira. O fotorreceptor retiniano é a camada do segmento externo da retina composta por células especializadas responsáveis pela fototransdução (isto é, conversão de luz em sinais neuronais). As células fotorreceptoras do bastonete e do cone estão adjacentes à camada pigmentada da retina (EPR)1. A terapia de reposição de células fotorreceptoras para compensar a perda celular tem sido uma abordagem terapêutica emergente e em desenvolvimento. Células-tronco embrionárias (CTEs)2,3,4, células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) derivadas de EPRs e células progenitoras da retina (RPCs)4,5,6,7,8 foram usadas para restaurar as células fotorreceptoras danificadas. O espaço sub-retiniano, um espaço confinado entre a retina e o EPR, é um local atraente para depositar essas células para substituir as células fotorreceptoras danificadas, o EPR e as células de Mueller devido à sua vizinhança9,10,11.
Terapias gênicas e celulares têm utilizado o espaço sub-retiniano para medicina regenerativa para várias doenças retinianas em estudos pré-clínicos. Isso inclui a entrega de cópias funcionais do gene ou ferramentas de edição gênica na forma de terapia anti-senso com oligonucleotídeos12,13 ou CRISPR/Cas9 ou edição de base via estratégia baseada em vírus adenoassociado (AAV) 14,15,16, implantação de materiais (por exemplo, folha de EPR, próteses retinianas 17,18,19) e organoides retinianos derivados de células-tronco diferenciadas 20,21,22 para tratar doenças retinianas e relacionadas à EPR. Ensaios clínicos utilizando hESC-RPE31 no espaço sub-retiniano para tratar amaurose congênita de Leber (LCA) associada ao EPR6523,24, acromatopsia ligada ao CNGA325, retinite pigmentosa associada a MERTK26, coroideremia 27,28,29,30 provaram ser uma abordagem eficaz. A injeção direta de células nas proximidades da área danificada melhora muito a chance de assentamento celular na região apropriada, integração sináptica e eventual melhora visual.
Embora a injeção sub-retiniana em modelos humanos e de olhos grandes (i.e., porco 32,33,34,35, coelho 36,37,38,39,40 e primata não humano 41,42,43) tenha sido estabelecida, tal injeção no modelo murino ainda é desafiadora devido à restrição do tamanho do globo ocular e enorme lente ocupando o olho do rato 44,45,46. No entanto, modelos geneticamente modificados só estão prontamente disponíveis em pequenos animais e não em animais de grande porte (ou seja, coelhos e primatas não humanos), portanto, a injeção sub-retiniana em camundongos chama a atenção para investigar novas abordagens terapêuticas em doenças genéticas da retina. Três abordagens principais estão sendo usadas para entregar células ou AAVs no espaço sub-retiniano: a via transcorneana, a via transescleral e a via pars plana (ver Figura 2). As vias transcórnea e transescleral estão associadas à formação de catarata, sinéquias, sangramento de coroide e refluxo do local da injeção 11,44,45,47,48,49. Adotamos a abordagem pars plana como visualização direta do processo de injeção, e o local de injeção pode ser obtido em tempo real ao microscópio.
Recentemente, descrevemos um método que pode diferenciar células-tronco embrionárias humanas (hESCs) em progenitores fotorreceptores sob condições xenofree, quimicamente definidas, usando a isoforma LN523 recombinante de laminina específica da retina humana. Uma vez que o LN523 estava presente na retina, hipotetizamos que o nicho da matriz extracelular da retina humana poderia ser recapitulado in vitro e, assim, apoiar a diferenciação dos fotorreceptores das hESCs36. A análise transcriptômica de célula única mostrou que progenitores fotorreceptores co-expressando homeobox e recuperatina cone-rod foram gerados após 32 dias. Um modelo mutante de camundongo com degeneração retiniana 10 (rd10) que imita retinose pigmentar humana autossômica foi usado para avaliar a eficácia dos progenitores de fotorreceptores derivados do hESC do dia 32 in-vivo. As células progenitoras do fotorreceptor derivadas do hESC foram injetadas no espaço sub-retiniano de camundongos rd10 em P20, onde a disfunção e a degeneração dos fotoceptores estão em curso36. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a preparação dos progenitores fotorreceptores derivados de hESC pós-criopreservados e liberação no espaço sub-retiniano de camundongos rd10 . Este método também pode ser usado para administrar AAVs, suspensões celulares, peptídeos ou produtos químicos no espaço sub-retiniano em camundongos.
A injeção sub-retiniana tem sido utilizada para transplante de suspensão celular para tratamento de EPR e doenças retinianas23,25,26,27,28,31,40. Esta abordagem é altamente essencial em estudos com roedores, não apenas para abordagens de transplante celular e terapia gênica, mas tamb?…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Wei Sheng Tan, Luanne Chiang Xue Yen, Xinyi Lee e Yingying Chung por fornecerem assistência técnica para a preparação do dia 32 progenitores fotorreceptores derivados de hESC após criopreservação. Este trabalho foi apoiado em parte por subsídios do National Medical Research Council Young Investigator Research Grant Award (NMRC/OFYIRG/0042/2017) e National Research Foundation24th Competitive Research Program Grant (CRP24-2020-0083) para H.G.T.
0.3% Tobramycin | Novartis | NDC 0078-0813-01 | Tobrex (3.5 g) |
0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone | Novartis | NDC 0078-0876-01 | Tobradex (3.5 g) |
0.5% Proparacaine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0016-15 | 0.5% Alcaine (15 mL) |
1 mL Tuberculin syringe | Turemo | SS01T2713 | |
1% Tropicamide | Alcon | NDC 0998-0355-15 | 1% Mydriacyl (15 mL) |
2.5% Phenylephrine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0342-05 | 2.5% Mydfrin (5 mL) |
24-well tissue culture plate | Costar | 3526 | |
30 G Disposable needle | Becton Dickinson (BD) | 305128 | |
33 G, 20 mm length blunt needles | Hamilton | 7803-05 | |
Automated Cell Counter | NanoEnTek | Model: Eve | |
B27 without Vitamin A | Life Technologies | 12587001 | 2%36 |
Buprenorphine | Ceva | Vetergesic vet (0.3 mg/mL) | |
CKI-7 | Sigma | C0742 | 5 µM36 |
Cyclosporine | Novartis | 260 g/L in drinking water | |
Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells | DUKE-NUS Medical School | Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36. | |
Gauze | Winner Industries Co. Ltd. | 1SNW475-4 | |
Glasgow Minimum Essential Medium | Gibco | 11710–035 | |
hESC cell line H1 | WiCell Research Institute | WA01 | |
Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02-50 | 10 ng/mL36 |
Human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Prospec-Tany Technogene | CYT-272 | 10 ng/mL36 |
Ketamine hydrochloride (100 mg/mL) | Ceva Santé Animale | KETALAB03 | |
LN-521 | Biolamina | LN521-02 | 1 µg36 |
mFreSR | STEMCELL Technologies | 5854 | |
Microlitre glass syringe (10 mL) | Hamilton | 7653-01 | |
N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT) | Selleckchem | S2215 | 10 µM36 |
N-2 supplement | Life Technologies | A13707-01 | 1%36 |
Non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140–050 | 1x36 |
NutriStem XF Media | Satorius | 05-100-1A | |
Operating microscope | Zeiss | OPMI LUMERA 700 | With Built-in iOCT function |
PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml) | DUKE-NUS Medical School | See media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA). | |
Pyruvate | Gibco | 11360–070 | 1 mM36 |
Rd10 mice | Jackson Laboratory | B6.CXB1-Pde6brd10/J mice | Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g |
Retinoic acid | Tocris Bioscience | 0695/50 | 0.5 µM36 |
Round Cover Slip (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
SB431542 | Sigma | S4317 | 0.5 µM36 |
Vidisic Gel (10 g) | Dr. Gerhard Mann | ||
Xylazine hydrochloride (20 mg/mL) | Troy Laboratories | LI0605 | |
β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985–023 | 0.1 mM36 |