Vi beskriver ett detaljerat protokoll för framställning av post-kryokonserverade hESC-härledda fotoreceptorprogenitorceller och subretinal leverans av dessa celler i rd10-möss .
Regenerering av fotoreceptorceller med hjälp av humana pluripotenta stamceller är en lovande terapi för behandling av både ärftliga och åldrande näthinnesjukdomar i avancerade stadier. Vi har visat att human rekombinant retina-specifik lamininisoformmatris kan stödja differentieringen av humana embryonala stamceller (hESC) till fotoreceptorprogenitorer. Dessutom har subretinal injektion av dessa celler också visat partiell återställning i rd10-gnagar – och kaninmodellerna. Subretinal injektion är känd för att vara en etablerad metod som har använts för att leverera farmaceutiska föreningar till fotoreceptorcellerna och retinal pigmenterad epitel (RPE) i ögat på grund av dess närhet till målutrymmet. Det har också använts för att leverera adeno-associerade virala vektorer till det subretinala utrymmet för att behandla näthinnesjukdomar. Den subretinala leveransen av farmaceutiska föreningar och celler i den murina modellen är utmanande på grund av begränsningen i storleken på den murina ögongloben. Detta protokoll beskriver den detaljerade proceduren för beredning av hESC-härledda fotoreceptorstamceller för injektion och subretinal leveransteknik för dessa celler i genetisk retinitis pigmentosa-mutant, rd10-möss . Detta tillvägagångssätt möjliggör cellterapi till målområdet, i synnerhet det yttre kärnskiktet i näthinnan, där sjukdomar som leder till fotoreceptordegeneration uppstår.
Ärftliga näthinnesjukdomar och åldersrelaterad makuladegeneration leder till förlust av fotoreceptorceller och slutligen blindhet. Den retinala fotoreceptorn är det yttre segmentskiktet av näthinnan som består av specialiserade celler som ansvarar för fototransduktion (dvs. omvandling av ljus till neuronala signaler). Stav- och tappfotoreceptorcellerna ligger intill det retinala pigmenterade skiktet (RPE)1. Ersättningsterapi med fotoreceptorceller för att kompensera cellförlusten har varit ett framväxande och utvecklande terapeutiskt tillvägagångssätt. Embryonala stamceller (ESC)2,3,4, inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs)-härledda RPE-celler och retinala stamceller (RPC)4,5,6,7,8 användes för att återställa de skadade fotoreceptorcellerna. Subretinalt utrymme, ett begränsat utrymme mellan näthinnan och RPE, är en attraktiv plats för att deponera dessa celler för att ersätta skadade fotoreceptorceller, RPE och Mueller-celler på grund av dess närhet 9,10,11.
Gen- och cellterapier har utnyttjat det subretinala utrymmet för regenerativ medicin för olika näthinnesjukdomar i prekliniska studier. Detta inkluderar leverans av funktionella kopior av gen- eller genredigeringsverktygen i form av antingen antisensoligonukleotidterapi12,13 eller CRISPR/Cas9 eller basredigering via adenoassocierat virus (AAV) baserad strategi 14,15,16, implantation av material (t.ex. RPE-ark, näthinneproteser 17,18,19) och differentierade stamcellsderiverade retinala organoider 20,21,22 för att behandla näthinne- och RPE-relaterade sjukdomar. Kliniska prövningar med hESC-RPE31 i subretinalt utrymme för att behandla RPE65-associerad Leber kongenital amauros (LCA)23,24, CNGA3-kopplad akromatopsi25, MERTK-associerad retinitis pigmentosa26, choroiderema 27,28,29,30 har visat sig vara ett effektivt tillvägagångssätt. Direkt injektion av celler i närheten av det skadade området förbättrar avsevärt chansen för cellsättning i lämplig region, synaptisk integration och eventuell visuell förbättring.
Även om subretinal injektion i mänskliga och storögda modeller (dvs. gris 32,33,34,35, kanin 36,37,38,39,40 och icke-mänsklig primat 41,42,43) har fastställts, är sådan injektion i den murina modellen fortfarande utmanande på grund av begränsningen av ögonglobens storlek och enorma lins som upptar musögat 44,45,46. Genetiskt modifierade modeller är dock endast lätt tillgängliga hos små djur och inte hos stora djur (dvs. kaniner och icke-mänskliga primater), därför uppmärksammar subretinal injektion i möss att undersöka nya terapeutiska metoder vid retinala genetiska sjukdomar. Tre huvudsakliga tillvägagångssätt används för att leverera celler eller AAV till det subretinala utrymmet, nämligen transhornhinnan, transskleral väg och pars plana-vägen (se figur 2). Hornhinne- och transsklerala vägar är förknippade med kataraktbildning, synechier, koroidal blödning och reflux från injektionsstället 11,44,45,47,48,49. Vi antog pars plana-metoden som en direkt visualisering av injektionsprocessen, och injektionsstället kan uppnås i realtid under mikroskopet.
Vi beskrev nyligen en metod som kan differentiera humana embryonala stamceller (hESC) till fotoreceptorprogenitorer under xenofria, kemiskt definierade förhållanden med hjälp av rekombinant human retina-specifik lamininisoform LN523. Eftersom LN523 visade sig finnas i näthinnan, antog vi att den extracellulära matrixnischen i den mänskliga näthinnan kunde rekapituleras in vitro och därmed stödja fotoreceptordifferentiering från hESCs36. Transkriptomisk analys av enskilda celler visade att fotoreceptorprogenitorer som samuttrycker kon-stav, homeobox och recoverin genererades efter 32 dagar. En retinal degeneration 10 (rd10) mutant musmodell som efterliknar autosomal human retinitis pigmentosa användes för att utvärdera effekten av dag 32 hESC-härledda fotoreceptorstamceller in vivo. De hESC-härledda fotoreceptorstamcellerna injicerades i det subretinala utrymmet hos rd10-möss vid P20, där fotoceptordysfunktion och degeneration pågår36. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för beredning av de post-kryokonserverade hESC-härledda fotoreceptorprogenitorerna och leverans till det subretinala utrymmet hos rd10-möss . Denna metod kan också användas för att administrera AAV, cellsuspensioner, peptider eller kemikalier i det subretinala utrymmet hos möss.
Den subretinala injektionen har använts för cellsuspensionstransplantation för att behandla RPE och näthinnesjukdomar 23,25,26,27,28,31,40. Detta tillvägagångssätt är mycket viktigt i gnagarstudier, inte bara för celltransplantation och genterapi, utan också för att utvärdera nya…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Wei Sheng Tan, Luanne Chiang Xue Yen, Xinyi Lee och Yingying Chung för att ha tillhandahållit tekniskt stöd för beredningen av dag 32 hESC-härledda fotoreceptorprogenitorer efter kryokonservering. Detta arbete stöddes delvis av anslag från National Medical Research Council Young Investigator Research Grant Award (NMRC/OFYIRG/0042/2017) och National Research Foundation 24th Competitive Research Program Grant (CRP24-2020-0083) till H.G.T.
0.3% Tobramycin | Novartis | NDC 0078-0813-01 | Tobrex (3.5 g) |
0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone | Novartis | NDC 0078-0876-01 | Tobradex (3.5 g) |
0.5% Proparacaine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0016-15 | 0.5% Alcaine (15 mL) |
1 mL Tuberculin syringe | Turemo | SS01T2713 | |
1% Tropicamide | Alcon | NDC 0998-0355-15 | 1% Mydriacyl (15 mL) |
2.5% Phenylephrine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0342-05 | 2.5% Mydfrin (5 mL) |
24-well tissue culture plate | Costar | 3526 | |
30 G Disposable needle | Becton Dickinson (BD) | 305128 | |
33 G, 20 mm length blunt needles | Hamilton | 7803-05 | |
Automated Cell Counter | NanoEnTek | Model: Eve | |
B27 without Vitamin A | Life Technologies | 12587001 | 2%36 |
Buprenorphine | Ceva | Vetergesic vet (0.3 mg/mL) | |
CKI-7 | Sigma | C0742 | 5 µM36 |
Cyclosporine | Novartis | 260 g/L in drinking water | |
Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells | DUKE-NUS Medical School | Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36. | |
Gauze | Winner Industries Co. Ltd. | 1SNW475-4 | |
Glasgow Minimum Essential Medium | Gibco | 11710–035 | |
hESC cell line H1 | WiCell Research Institute | WA01 | |
Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02-50 | 10 ng/mL36 |
Human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Prospec-Tany Technogene | CYT-272 | 10 ng/mL36 |
Ketamine hydrochloride (100 mg/mL) | Ceva Santé Animale | KETALAB03 | |
LN-521 | Biolamina | LN521-02 | 1 µg36 |
mFreSR | STEMCELL Technologies | 5854 | |
Microlitre glass syringe (10 mL) | Hamilton | 7653-01 | |
N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT) | Selleckchem | S2215 | 10 µM36 |
N-2 supplement | Life Technologies | A13707-01 | 1%36 |
Non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140–050 | 1x36 |
NutriStem XF Media | Satorius | 05-100-1A | |
Operating microscope | Zeiss | OPMI LUMERA 700 | With Built-in iOCT function |
PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml) | DUKE-NUS Medical School | See media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA). | |
Pyruvate | Gibco | 11360–070 | 1 mM36 |
Rd10 mice | Jackson Laboratory | B6.CXB1-Pde6brd10/J mice | Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g |
Retinoic acid | Tocris Bioscience | 0695/50 | 0.5 µM36 |
Round Cover Slip (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
SB431542 | Sigma | S4317 | 0.5 µM36 |
Vidisic Gel (10 g) | Dr. Gerhard Mann | ||
Xylazine hydrochloride (20 mg/mL) | Troy Laboratories | LI0605 | |
β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985–023 | 0.1 mM36 |