Summary
Denne eksperimentelle protokol beskriver og optimerer en multiplex immunohistokemi (IHC) farvningsmetode, hovedsageligt ved at optimere enkeltkanals antistofinkubationsbetingelser og justere indstillingerne for antistoffer og kanaler for at løse problemerne med autofluorescens og kanalkrydstale i lungekræftvæv af klinisk oprindelse.
Abstract
Lungekræft er den førende årsag til ondartet tumorrelateret sygelighed og dødelighed over hele verden, og det komplekse tumormikromiljø er blevet betragtet som den største dødsårsag hos lungekræftpatienter. Kompleksiteten af tumormikromiljøet kræver effektive metoder til at forstå celle-til-celle-forhold i tumorvæv. Multiplex immunhistokemi (mIHC) teknikken er blevet et vigtigt redskab til at udlede forholdet mellem ekspression af proteiner opstrøms og nedstrøms for signalveje i tumorvæv og udvikle kliniske diagnoser og behandlingsplaner. mIHC er en multi-label immunofluorescensfarvningsmetode baseret på Tyramin Signal Amplification (TSA) teknologi, som samtidig kan detektere flere målmolekyler på den samme vævssektionsprøve for at opnå forskellige proteinco-ekspression og co-lokaliseringsanalyse. I denne eksperimentelle protokol blev paraffinindlejrede vævssektioner af lungepladekarcinom af klinisk oprindelse udsat for multiplex immunohistokemisk farvning. Ved at optimere den eksperimentelle protokol blev multiplex immunohistokemisk farvning af mærkede målceller og proteiner opnået, hvilket løste problemet med autofluorescens og kanalkrydstale i lungevæv. Derudover anvendes multiplex immunohistokemisk farvning i vid udstrækning til eksperimentel validering af tumorrelateret sekventering med høj kapacitet, herunder enkeltcellesekventering, proteomics og vævsrumsekventering, hvilket giver intuitive og visuelle patologiske valideringsresultater.
Introduction
Tyraminsignalforstærkning (TSA), som har en historie på mere end 20 år, er en klasse af analyseteknikker, der bruger peberrodsperoxidase (HRP) til in situ-mærkning med høj densitet af målantigener og anvendes i vid udstrækning i enzymbundne immunosorbentassays (ELISA'er), in situ-hybridisering (ISH), immunhistokemi (IHC) og andre teknikker til påvisning af biologiske antigener, væsentlig forbedring af følsomheden af det detekterede signal1. Opal polykromatisk farvning baseret på TSA-teknologi er for nylig blevet udviklet og udbredt i flere undersøgelser 2,3,4,5. Traditionel immunfluorescens (IF) farvning giver forskere et nemt værktøj til påvisning og sammenligning af fordelingen af proteiner i celler og væv fra forskellige modelorganismer. Den er baseret på antistof-/antigenspecifik binding og omfatter direkte og indirekte tilgange6. Direkte immunfarvning involverer anvendelse af et fluoroforkonjugeret primært antistof mod antigenet af interesse, hvilket muliggør direkte fluorescerende detektion ved anvendelse af et fluorescensmikroskop. Den indirekte immunfarvningsmetode indebærer anvendelse af et fluoroforkonjugeret sekundært antistof mod det ukonjugerede primære antistof 6,7.
Traditionelle, enkeltmærkede, immunofluorescensfarvningsmetoder kan kun plette en, to eller i nogle tilfælde tre antigener i væv, hvilket er en stor begrænsning i minedrift af de rige oplysninger indeholdt i vævssektioner. Fortolkningen af kvantitative resultater afhænger ofte af visuel observation og nøjagtig kvantificering ved hjælp af billedbehandlingssoftware, såsom ImageJ. Der er tekniske begrænsninger, såsom begrænsning af antistofarter, svage fluorescerende etiketsignaler og fluorescerende farvestoffarveoverlapning (tabel 1). Opal multiplex IHC (mIHC) teknikken er baseret på TSA-afledning, som tillader multiplexfarvning og differentiel mærkning af mere end 7-9 antigener på samme vævssektion uden begrænsning af oprindelsen af det primære antistof, men kræver høj specificitet af det tilsvarende antistof mod antigenet. Farvningsproceduren svarer til den normale immunofluorescensfarvning, bortset fra to forskelle: hver farvningsrunde involverer kun anvendelse af et antistof, og der tilsættes et antistofelueringstrin. Antistoffer bundet til antigenet ved ikke-kovalente bindinger kan fjernes ved mikrobølgeeluering, men TSA-fluorescerende signal bundet til overfladen af antigenet ved kovalente bindinger bevares.
Aktiverede tyramin (T) molekyler mærket med farvestoffet er stærkt beriget ved målantigenet, hvilket muliggør effektiv forstærkning af det fluorescerende signal. Dette muliggør direkte mærkning af antigenet uden antistofinterferens, og derefter kan flerfarvet mærkning opnås efter flere farvningscyklusser 8,9,10 (figur 1). Selvom denne teknologi producerer pålidelige og nøjagtige billeder til undersøgelse af sygdom, kan oprettelsen af en nyttig multiplex fluorescerende immunhistokemi (mfIHC) farvningsstrategi være tidskrævende og krævende på grund af behovet for omfattende optimering og design. Derfor er denne multiplexpanelprotokol optimeret i en automatiseret IHC-farvning med en kortere farvningstid end den manuelle protokol. Denne fremgangsmåde kan anvendes direkte og tilpasses af enhver forsker til immuno-onkologiske undersøgelser af humane formalinfikserede og paraffinindlejrede (FFPE) vævsprøver11. Desuden vil metoderne til diasforberedelse, antistofoptimering og multiplexdesign være nyttige til at opnå robuste billeder, der repræsenterer nøjagtige cellulære interaktioner in situ og til at forkorte optimeringsperioden for manuel analyse12.
mfIHC omfatter hovedsageligt billedoptagelse og dataanalyse. Med hensyn til billedoptagelse skal flerfarvede mærkede komplekse farvede prøver detekteres med professionelt spektralbilleddannelsesudstyr for at identificere de forskellige blandede farvesignaler og opnå billeder med højt signal til støj uden interferens fra vævsautofluorescens. Nuværende udstyr til spektral billeddannelse omfatter hovedsageligt spektrale konfokale mikroskoper og multispektrale vævsbilleddannelsessystemer. Det multispektrale vævsbilleddannelsessystem er et professionelt billeddannelsessystem designet til kvantitativ analyse af vævssektioner, og dets vigtigste træk er erhvervelsen af billedspektral information, som giver både morfologisk struktur og optisk kortlægningsinformation af biologiske vævsprøver13,14. Enhver pixel i spektralbilledet indeholder en komplet spektralkurve, og hvert farvestof (inklusive autofluorescens) har sit tilsvarende karakteristiske spektrum, som muliggør fuldstændig registrering og nøjagtig identifikation af blandede og overlappende multilabel-signaler.
Med hensyn til dataanalyse er flerfarvede mærkede prøver ekstremt komplekse på grund af vævsprøvernes morfologiske struktur og bestanddele. Almindelig software kan ikke automatisk identificere forskellige vævstyper. Derfor anvendes intelligent kvantitativ vævsanalysesoftware til kvantitativ analyse af antigenekspression i specifikke regioner 15,16,17,18.
Frem for alt har multilabel immunofluorescensfarvning smeltet sammen med multispektral billeddannelse og kvantitativ patologianalyseteknologi fordelene ved et stort antal detektionsmål, effektiv farvning og nøjagtig analyse, og det kan derfor forbedre nøjagtigheden af histomorfologisk analyse betydeligt, afsløre det rumlige forhold mellem proteiner med opløsning på celleniveau og hjælpe med at udvinde rigere og mere pålidelige oplysninger fra vævssektionsprøver19 (Tabel 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen er godkendt af retningslinjerne fra den etiske komité på West China Hospital, Sichuan University, Kina. Lungekræftvævsprøverne blev opnået under operationen i Center of Lung Cancer på West China Hospital, og der blev indhentet informeret samtykke fra hver patient.
1. Forberedelse af vævssektion
- FFPE forberedelse
- Dyp klinisk væv i neutral formalinopløsning i mere end 72 timer.
- Processen med dehydrering af vævene afsluttes med xylen og klassificerede alkoholiske opløsninger20.
- Udfør manuel paraffinindlejring og vævssektionering ved 4 μm sektionstykkelse. Brug vedhæftningsmikroskopglas for at sikre, at vævsskiverne ikke falder ud.
- Bag objektglassene i en ovn ved 65 °C i 2 timer for at sikre, at serviettet og objektglassene er tørre. Opbevares i en diasboks ved stuetemperatur.
- Forbehandling af vævssektion
- Forbehandle vævsobjektglassene i en ovn ved 65 °C i 5 minutter og derefter nedsænkes sekventielt i xylenopløsninger i 2 x 15 min, vandfrie ethanolopløsninger i 2 x 15 min, 90% ethanolopløsning i 10 minutter, 85% ethanolopløsning i 10 minutter, 80% ethanolopløsning i 10 minutter og 75% ethanolopløsning i 10 minutter, efterfulgt af vask af diasene med steriliseret vand i 3 x 1 min.
BEMÆRK: Denne eksperimentelle teknik kan kun bruges til FFPE-væv, ikke til frosset eller frisk væv, da den multiple antigenreparationsproces ved høj temperatur får vævet til at falde af diaset.
- Forbehandle vævsobjektglassene i en ovn ved 65 °C i 5 minutter og derefter nedsænkes sekventielt i xylenopløsninger i 2 x 15 min, vandfrie ethanolopløsninger i 2 x 15 min, 90% ethanolopløsning i 10 minutter, 85% ethanolopløsning i 10 minutter, 80% ethanolopløsning i 10 minutter og 75% ethanolopløsning i 10 minutter, efterfulgt af vask af diasene med steriliseret vand i 3 x 1 min.
2. Optimering af primært antistof
BEMÆRK: Konventionelle IHC-eksperimenter blev brugt til at bestemme inkubationsbetingelserne for individuelle antistoffer, hovedsageligt inklusive antistofkoncentration og antigenreparationsbetingelser. Se betingelserne i antistofbrugsanvisningen.
- Brug en antistofkoncentration, der er lidt højere end det anbefalede koncentrationsområde og mellemværdier.
- Optimer antigenhentningsbufferrutinerne PH6 og PH9 i henhold til placeringen af proteinekspression. Brug PH9 til proteiner udtrykt i kernen og brug enten rutine (PH6 eller PH9) til andre proteiner.
3. mIHC farvning metode
BEMÆRK: Opal mIHC-farvning er en af de tilgængelige mIHC-metoder. I denne eksperimentelle 5-farveprotokol, da hver vævsprøve skal farves med fire antistoffer, er fire primære antistofinkubationer, sekundære antistofinkubationer og TSA-signalforstærkning kromogene inkubationer samt fem antigenrestaureringer nødvendige. Endelig udføres 4'6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) farvning og tætning af antifluorescerende sprængningsmiddel.
- Fremstilling af hovedreagens
BEMÆRK: Bestem mængden af reagens, der skal tilsættes i henhold til størrelsen af vævsglassene. Brug nok volumen til helt at dække vævssektionen (generelt 50-150 μL pr. Objektglas). De arbejdsløsninger, der kræves til eksperimentet, fremstilles som følger:- Arbejdsløsning til vaskebuffer: Fortynd 20x vaskebuffer ved 1:20 med dobbeltdestilleret vand og opbevar ved stuetemperatur.
- PH6-bufferarbejdsløsning: Fortynd 100x PH6-buffer ved 1:100 med dobbeltdestilleret vand. Forbered før brug og opbevar ved stuetemperatur.
- PH9-bufferarbejdsløsning: Fortynd 50x PH9-buffer ved 1:50 med dobbeltdestilleret vand. Forbered før brug og opbevar ved stuetemperatur.
- Polymer HRP: Forbered kun denne brugsklare opløsning til primære antistoffer af kanin- og museoprindelse.
- Fluorofor arbejdsløsning: Rekonstituer hvert fluoroforpulver (undtagen fluorofor 780) i 75 μL DMSO. Før hver procedure fortyndes fluoroforen i 1x amplifikationsfortyndingsmiddel ved 1:100. Kassér eventuelle ubrugte dele af fluoroforarbejdsløsningen.
- Fluorofor 780 Arbejdsløsning: Rekonstituer TSA-DIG i 75 μL DMSO og fluoroforpulveret 780 i 300 μL dobbeltdestilleret vand. Før proceduren fortyndes TSA-DIG i 1x amplifikationsfortyndingsmiddel ved 1:100 og fortyndes fluorofor 780 med Ab-fortyndingsmiddel ved 1:25.
- DAPI-arbejdsløsning: Fortynd DAPI-opløsningen ved 1:50 med dobbeltdestilleret vand eller PBS. Klargøres før brug og opbevares ved 4 °C i højst 48 timer.
SEDDEL. Vask kun diasene med dobbeltdestilleret vand og frisklavet vaskebufferarbejdsløsning under hele dette multilabel fluorescensfarvningseksperiment. Vævssektioner må ikke komme i kontakt med ledningsvand; Forurenende stoffer i ledningsvandet kan klæbe til vævssektionerne og forårsage autofluorescens. Hold prøverne væk fra lys under hele eksperimentet.
- Antigen hentning
- Placer diasene i en farvnings- og reparationskasse og fyld den med PH6 eller PH9 buffer arbejdsløsning, dæk med låget og opvarm i en mikrobølgeovn i 2 x 8 min ved 100% effekt.
BEMÆRK: Tilsæt dobbeltdestilleret vand til reparationsboksen under opvarmningsprocessen for at forhindre overdreven fordampning, der kan få skiverne til at tørre ud. - Lad rutsjebanerne køle af ved stuetemperatur, inden du fortsætter (30-60 min).
- Vask rutsjebanerne 3 x 2 min med dobbeltdestilleret vand. Brug en hydrofob barrierepen til at omkranse vævssektionen på diaset.
- Placer diasene i en farvnings- og reparationskasse og fyld den med PH6 eller PH9 buffer arbejdsløsning, dæk med låget og opvarm i en mikrobølgeovn i 2 x 8 min ved 100% effekt.
- Blokering
- Nedsænk vævssektioner i vaskebuffer, dæk med blokeringsopløsning, og inkuber dias i et befugtet kammer ved stuetemperatur i 10 minutter.
- Primær antistofinkubation
- Fjern blokeringsopløsningen fra diasene og dæk vævssektionerne med den primære antistofarbejdsløsning. Objektglassene inkuberes i et befugtet kammer i 1 time ved 37 °C i inkubatoren eller natten over ved 4 °C i køleskabet.
BEMÆRK: Lad ikke lysbillederne tørre ud.
- Fjern blokeringsopløsningen fra diasene og dæk vævssektionerne med den primære antistofarbejdsløsning. Objektglassene inkuberes i et befugtet kammer i 1 time ved 37 °C i inkubatoren eller natten over ved 4 °C i køleskabet.
- Introduktion af polymer HRP
- Vask objektglassene i vaskebufferarbejdsløsningen i 3 x 2 min. Tilsæt Polymer HRP direkte dråbevis til vævssektioner og inkuber i 15 min ved stuetemperatur.
BEMÆRK: For dias, der opbevares i køleskabet, skal de opbevares ved stuetemperatur i ca. 30 minutter før vask for at fjerne det primære antistof.
- Vask objektglassene i vaskebufferarbejdsløsningen i 3 x 2 min. Tilsæt Polymer HRP direkte dråbevis til vævssektioner og inkuber i 15 min ved stuetemperatur.
- Generering af tyraminsignalforstærkning (TSA)
- Vask objektglasset med vaskebufferarbejdsløsning i 3 x 2 min, tilsæt fluoroforarbejdsløsning direkte dråbevis til vævssektionerne, og inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur. Vask objektglasset med vaskebuffer arbejdsløsning i 3 x 2 min.
- Særlig procedure for fluorofor 780
BEMÆRK: Fluorofor 780 er svag og placeres rutinemæssigt sidst i farvematchningsskemaet for hele eksperimentet. Fluorofor 780 anvendes normalt ikke i denne eksperimentelle protokol, men på grund af dets specificitet er dets eksperimentelle trin opført.- Introduktion af TSA-DIG
- Vask objektglasset med vaskebufferarbejdsløsningen i 3 x 2 min, tilsæt TSA-Drg-arbejdsløsningen dråbevis til vævssektionerne, og inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Mikrobølge behandling
- Vask rutsjebanerne med vaskebuffer arbejdsløsning i 3 x 2 min.
- Placer diasene i en farvnings- og reparationskasse, fyld den med reparationsopløsning, dæk med låget og opvarm i en mikrobølgeovn i 2 x 8 minutter ved 100% effekt. Lad rutsjebanerne køle af ved stuetemperatur, inden du fortsætter (30-60 min).
- Vask rutsjebanerne i 3 x 2 min med dobbeltdestilleret vand.
- Generering af fluorofor 780 signal
- Dyp sektionerne i vaskebuffer, dæk med fluorofor 780 arbejdsløsning, og inkuber diasene i et befugtet kammer i 1 time ved stuetemperatur.
- Vask rutsjebanerne med vaskebuffer arbejdsløsning i 3 x 2 min.
BEMÆRK: Udfør IKKE mikrobølgebehandling efter dette trin.
- Brug fluorofor 780 som det sidste trin i hele arbejdsgangen, og pletter derefter kerner direkte med DAPI-arbejdsløsningen.
BEMÆRK: Spring trin 3.7 over, hvis du ikke bruger fluorofor 780.
- Introduktion af TSA-DIG
- Mikrobølge behandling
BEMÆRK: Dette mikrobølgetrin stripper det primære-sekundære HRP-kompleks og genudsætter antigener, hvilket muliggør introduktion af det næste primære antistof.- Placer diasene i en farvnings- og reparationskasse, fyld den med PH6- eller PH9-bufferarbejdsløsning, dæk med låget og opvarm i en mikrobølgeovn i 2 x 8 minutter ved 100% effekt.
- Lad rutsjebanerne køle af ved stuetemperatur, inden du fortsætter (30-60 min). Vask rutsjebanerne 3 x 1 min med dobbeltdestilleret vand.
- Dyp dias i vaskebuffer arbejdsløsning i 2 min. Udfør den næste antistofinkubation.
- Næste antistofinkubation
- Gentag trin 3.2-3.8 (undtagen trin 3.7).
- Cellekernefarvning og vævsforsegling
- Dæk vævssektionerne med DAPI-arbejdsløsningen og inkuber diasene i et befugtet kammer i 5 minutter ved stuetemperatur. Vask rutsjebanerne i 3 x 2 min med dobbeltdestilleret vand.
- Fjern vanddråber fra diasene, tilsæt 10-20 μL antifluorescensslukker til hvert dias, og forsegl diasene med et mikroskopdækglas.
- Opbevar de færdige dias ved 4 °C, beskyttet mod lys, i mere end 1 måned.
BEMÆRK: Pas på at undgå luftbobler.
4. Konfigurer det negative kontrolelement
- Behandl de negative kontroldias som de vævsholdige dias, men uden tilsætning af reagenser såsom primære antistoffer, sekundære antistoffer, TSA-reagenser og DAPI, som bruges til at fjerne vævsautofluorescens ved scanning af filmen.
5. Fuldautomatisk scanning af vævsglas
BEMÆRK: Udstyret, der anvendes til spektral billeddannelse, er en fuldautomatisk multispektral vævskvantificeringsanalysator, og billeddannelse og analysevisualisering af 5-farvede dias kan udføres ved hjælp af det refererede system (se materialetabel). Systemet bruger multispektral billeddannelse til kvantitativ blanding af flere fluoroforer og vævsautofluorescens.
- Indstil eksponeringstiden og scanningsprogrammet manuelt for hver fluorescenskanal, og bekræft, at instrumentet har gennemført den fuldautomatiske eksponering og scanning af vævsglassene.
BEMÆRK: Glidefladen skal være ren og fri for vandfilm. Vær forsigtig med mængden af forsegler: for meget vil få dæksedlen til at glide og instrumentet til at rapportere en fejl.
6. Analyse af fluorescens
- Dobbeltklik på softwaren (se materialetabellen), træk den flerfarvede fluorescensbilledfil, der blev hentet fra den originale scanning, ind i softwaren, og indstil billedtypen til fluorescens.
- Klik på knappen Lysstyrke og kontrast , og kontroller kanalerne på panelet. Klik udenfor og derefter på kanalen for at vælge den fluorescenskanal, der er interessant. Træk Min. skærm og Max skærm for at justere lysstyrken og kontrasten for hver kanal.
- Efter analysen skal du bestemme den visning, der skal gemmes, klikke på Vis diasoversigt og Vis markørplacering for at fjerne disse to indhold, beholde skalalinjen og klikke på Filer | Eksportér snapshot | Aktuelt fremviserindhold for at eksportere en png-fil.
BEMÆRK: Hver fluorescenskanal og et fusioneret tal skal eksporteres til fremtidig analyse. - For yderligere analyse af målcellepositivitet, brug celleidentifikation og segmenteringssoftware21 (se materialetabel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi optimerede matchningsskemaet for CD8 primært antistof og fluoroforer. Begge sæt fluorescensresultater svarede til nøjagtig de samme antistofinkubationsbetingelser i forsøgsgruppen, bortset fra ændringen i den antistofmatchede fluorofor. Som vist i figur 2 var der en signifikant forskel i kanalmatchningen af CD8+ T-celler med fluorofor 480 og fluorofor 690. Kanalen med fluorofor 690 viser en ekstremt stærk fluorescerende baggrund - det store område med rød uregelmæssig fluorescens inden for den gule cirkel viser farve, hvilket forårsager stor interferens i lokaliseringsanalysen af CD8 + T-celler (figur 2C, D). Kanalen med fluorofor 480 viser imidlertid en meget specifik CD8-cellemembranpositivitet og ingen fluorescerende baggrund. Således viser de gule cirkler en meget klar positiv cellemembran (figur 2A), som fuldt ud illustrerer vigtigheden af antistof- og fluorescenskanalmatchning i denne protokol.
Fordelingen af makrofager og cytotoksiske T-celler blev undersøgt i ikke-småcellet lungepladekarcinomvæv, og ekspressionen af det karakteristiske protein HMGCS1 i tumorceller og immunceller blev verificeret. Som vist i figur 3 stammer billederne fra QuPath 0.3.2. mIHC-panelet var fluoroforer 480, 520, 620, 690 og DAPI, og de tilsvarende antistofmarkører var CK5/6, en markør for lungepladekarcinomceller; CD8, en markør for T-celler; CD68, en markør for makrofager; og HMGCS1, som er specifik for plasmapositive tumorceller. Makrofager og CD8 + T-celler viste kraftig infiltration og blev fordelt omkring og inden for pladekarcinomfoci, mens HMGCS1 blev bredt udtrykt i pladekarcinomcelleplasmaet, der viste stærk tumorcellepositivitet.
Figur 1: Arbejdsprocessen for multiplex immunohistokemisk farvning til FFPE-væv. Forkortelse: FFPE = formalinfikseret og paraffinindlejret. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Optimering af matchningsprotokollerne for CD8 og fluoroforer. Der var en signifikant forskel i kanalmatchningen af CD8 + T-celler med fluorofor 480 og fluorofor 690. Skalabjælker = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Multiplexed immunhistokemisk farvning i lungepladekarcinom. Fordelingen af makrofager og cytotoksiske T-celler i ikke-småcellet lungepladekarcinomvæv og ekspressionen af det karakteristiske protein HMGCS1 i tumorceller og immunceller. CK5/6 er en markør for lungepladekarcinomceller; CD8 er en markør for T-celler; CD68 er en markør for makrofager; og HMGCS1 er specifik for tumorcelleplasma-positive celler. Skalabjælker = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Multiplex immunhistokemi teknik | Traditionel immunfluorescensteknik | ||||
| Antal molekylære mål | Ubegrænset (op til 9 slags farvning på én gang, inklusive DAPI) | Generel mærkning 3-4 slags (inklusive DAPI) | |||
| Erhvervelse af billeder | Høj farvningsopløsning og farvningsspecificitet, signalforstærkning, stærk signalintensitet, længere slukningstid, ingen baggrundseffekt og meget højere signal-støj-forhold på hvert målsted. | Svag lysstyrke, let slukning, gensidig indflydelse mellem forskellige antistoffer, høj baggrund | |||
| Dataanalyse | Områdespecificitet, cellesegmentering, enkeltcelle rumlig information | Observation med det blotte øje og nøjagtig kvantificering af ImageJ | |||
Tabel 1: Sammenligning mellem Opal multi-labeling immunofluorescens teknologi og traditionel immunofluorescens teknologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
mIHC er en uundværlig eksperimentel teknik inden for videnskabelig forskning til kvantitativ og rumlig analyse af flere proteinmarkører på enkeltcelleniveau i et enkelt vævsafsnit, hvilket giver intuitive og nøjagtige data til undersøgelse af sygdomspatologi ved at fokusere på den detaljerede vævsstruktur og cellulære interaktioner i sammenhæng med det oprindelige væv. Den udbredte vedtagelse af mIHC-teknologi vil kræve optimerede og effektive eksperimentelle protokoller. For at løse de problemer, der kan opstå i eksperimenterne, præsenterer vi følgende overvejelser og løsninger.
For det første matches svagt udtrykt antigen i henhold til princippet om matchende antigen og fluoresceinmærket antistof i flerfarvede eksperimenter med stærkt fluoresceinmærket antistof, og stærkt udtrykt antigen matches med svagt fluoresceinmærket antistof. Kombineret med resultaterne af IHC-eksperimenter med enkelte antistofmærkede antigener bestemmes intensiteten af ekspressionen af målproteinet, og matchningen af antistof og fluorescein justeres, hvilket endelig bestemmer matchningsskemaet for antistof og fluorescein, der kræves i flerfarvede mærkningseksperimenter. Tilstødende fluorescenskanaler med forskellige proteinekspressionsniveauer af antistoffet kan løse problemet med tilstødende fluorescenskanalstrengfarve. For det andet blev softwareindstillingerne til detektering af fluorescenssignaler indstillet ved hjælp af Akoya Biosciences-billeddannelsessystemet til billeddannelse af farvede dias, og fluorescensoptagelsesparametrene blev indstillet ved hjælp af multispektral scanningssoftware Phenochart 1.0, som gør det muligt at kontrollere fluorescenssignalbalancen22. Det anbefales, at eksponeringstiden ligger inden for 100 ms for en enkelt fluorescenskanal og bør være mere homogen og ikke højere end 200 ms for flere fluorescenskanaler. Fluorescensparametrene justeres baseret på de IHC-optimerede antistofinkubationsbetingelser.
For det tredje kan problemet med autofluorescens analyseres ved at indstille en tom kontrol kombineret med den karakteristiske spektrale detektion af multispektral billeddannelse. Dette kan identificere de blandede farvesignaler og, for formalinfikserede paraffinindlejrede prøver, forbedre signal-støjforholdet mellem billederne med omtrent en størrelsesorden ved at fjerne vævsautofluorescens23. For det fjerde, for at behandle væv-uspecifik kromogenicitet, bør antistoffer med dårlig vævsspecificitet anvendes med animalsk ikke-immun serum som en blokerende opløsning, normalt tilsat før det primære antistof. De udvalgte serumarter er generelt de samme som kilden til de sekundære antistofarter, som kan reducere uspecifik kromogenicitet. For det femte anbefales det at indføre negativ kontrol og positiv kontrol som eksperimentel kvalitetskontrol. Den positive kontrol har rollen som at kontrollere kvaliteten af reagenser, og den negative kontrol har den dobbelte funktion at verificere kvaliteten af forsøgsprocedurerne og fjerne autofluorescens ved scanning af dias. Kombinationen kan bruges til at sikre nøjagtigheden af hvert eksperiment. For det sjette er diasvasketrinnet meget vigtigt under hele eksperimentet. De reagenser, der er fremstillet i protokollen, skal anvendes, og vasketiden skal bruges til at vaske reagenserne af diasene ved hvert trin for at forhindre interferens med mærkningen i næste trin.
Når specificiteten af en enkelt fluorescenskanal er dårlig, hvilket resulterer i uspecifik positivitet og fluorescenskrydstale, skal brugerne kontrollere IHC-resultatet af det relevante antistof, bekræfte det positive resultat og derefter overveje at ændre den relevante fluorofor. Hvis et enkelt positivt fluorescensresultat er for svagt eller for stærkt, er det vigtigt at nulstille filmscanningsparametrene til den anbefalede fluoroforeksponeringstid på 10-150 ms.
Denne multiple mærkningsmetode er i øjeblikket begrænset til paraffinindlejrede vævsprøver, da proteinmærkningsprocessen kræver flere antigene termiske reparationer, som kræver, at vævet fastgøres for at forhindre brud. Frosne sektioner af frisk væv modstår ikke skader forårsaget af termisk reparation, og store mængder væv vil gå tabt.
Sammenfattende er denne multiple antigen in situ-mærkningsmetode mindre tidskrævende med en enkelt antistofmærkningsprocestid på mindre end 3 timer. Det kombinerer fordelene ved et multispektralt billeddannelsessystem og professionel patologianalysesoftware for at optimere mIHC-eksperimentelle protokol med hensyn til individuelle proteinmærkningsbetingelser og eksperimentelle gruppe- og fluorescenskanalindstillinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende medlemmer af Clinical Pathology Research Institute West China Hospital, der bidrog med teknisk vejledning til kvalitet multiplex immunofluorescens og IHC behandling. Denne protokol blev støttet af National Natural Science Foundation of China (82200078).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Anti-CD8 | Abcam | ab237709 | Primary antibody, 1/100, PH9 |
| Anti-CD68 | Abcam | ab955 | Primary antibody, 1/300, PH9 |
| Anti-CK5/6 | Millipore | MAB1620 | Primary antibody, 1/150, PH9 |
| Anti-HMGCS1 | GeneTex | GTX112346 | Primary antibody, 1/300, PH6 |
| Animal nonimmune serum | MXB Biotechnologies | SP KIT-B3 | Antigen blocking |
| Fluormount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Anti-fluorescent burst |
| Opal PolarisTM 7-Color Manual IHC Kit | Akoya | NEL861001KT | Opal mIHC Staining |
| Wash Buffer | Dako | K8000/K8002/K8007/K8023 | Washing the tissues slides |
| Software | |||
| HALO | intelligent quantitative tissue analysis software, paid software | ||
| inForm | intelligent quantitative tissue analysis software, paid software | ||
| PerkinElmer Vectra | multispectral tissue imaging systems, fully automatic scanning of tissue slides. | ||
| QuPath 0.3.2 | intelligent quantitative tissue analysis software, open source software, used in this experiment. |
References
- Zaidi, A. U., Enomoto, H., Milbrandt, J., Roth, K. A. Dual fluorescent in situ hybridization and immunohistochemical detection with tyramide signal amplification. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48 (10), 1369-1375 (2000).
- Lovisa, S., et al. Epithelial-to-mesenchymal transition induces cell cycle arrest and parenchymal damage in renal fibrosis. Nature Medicine. 21 (9), 998-1009 (2015).
- Nghiem, P. T., et al. PD-1 blockade with pembrolizumab in advanced Merkel-cell carcinoma. The New England Journal of Medicine. 374 (26), 2542-2552 (2016).
- Zaretsky, J. M., et al. Mutations associated with acquired resistance to PD-1 blockade in melanoma. The New England Journal of Medicine. 375 (9), 819-829 (2016).
- Wang, C., et al. The heterogeneous immune landscape between lung adenocarcinoma and squamous carcinoma revealed by single-cell RNA sequencing. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 289 (2022).
- Becheva, Z. R., Gabrovska, K. I., Godjevargova, T. I. Comparison between direct and indirect immunofluorescence method for determination of somatic cell count. Chemical Papers. 72, 1861-1867 (2018).
- Niedenberger, B. A., Geyer, C. B. Advanced immunostaining approaches to study early male germ cell development. Stem Cell Research. 27, 162-168 (2018).
- Granier, C., et al. Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1+CD8+ T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma. Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).
- Badoual, C., et al. PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
- Meany, D. L., Hackler, L. Jr, Zhang, H., Chan, D. W. Tyramide signal amplification for antibody-overlay lectin microarray: a strategy to improve the sensitivity of targeted glycan profiling. Journal of Proteome Research. 10 (3), 1425-1431 (2011).
- Surace, M., et al. Automated multiplex immunofluorescence panel for immuno-oncology studies on formalin-fixed carcinoma tissue specimens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), 58390 (2019).
- Lazarus, J., et al. Optimization, design and avoiding pitfalls in manual multiplex fluorescent immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), 59915 (2019).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Mansfield, J. R. Multispectral imaging: a review of its technical aspects and applications in anatomic pathology. Veterinary Pathology. 51 (1), 185-210 (2014).
- Gustavson, M. D., et al. Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using Automated QUantitative Analysis. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 17 (4), 329-337 (2009).
- Lu, S., et al. Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncology. 5 (8), 1195-1204 (2019).
- Humphries, M. P., Maxwell, P., Salto-Tellez, M. QuPath: The global impact of an open source digital pathology system. Computational and Structural Biotechnology Journal. 19, 852-859 (2021).
- Bankhead, P., et al. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Scientific Reports. 7 (1), 16878 (2017).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Chapter 4, Experimental Pathology Techniques of Respiratory System. Atlas of Experimental Pathology Techniques. , 125-126 (2012).
- Wilson, C. M., et al. Challenges and opportunities in the statistical analysis of multiplex immunofluorescence data. Cancers. 13 (12), 3031 (2021).
- Mori, H., et al. Characterizing the tumor immune microenvironment with Tyramide-based multiplex immunofluorescence. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 417-432 (2020).
- Mansfield, J. R. Cellular context in epigenetics: quantitative multicolor imaging and automated per-cell analysis of miRNAs and their putative targets. Methods. 52 (4), 271-280 (2010).
