تحضير معلق أحادي الخلية من الشرايين السباتية للفأر لتسلسل الخلية الواحدة
Summary
نصف هنا بروتوكول هضم الخلايا المكون من خطوتين لإعداد تعليق أحادي الخلية للشرايين السباتية للفأر.
Abstract
الشرايين السباتية هي أوعية دموية رئيسية في الرقبة تمد الدماغ بالدم والأكسجين، ولكن يحدث تضيق الشريان السباتي عندما تكون الشرايين السباتية مسدودة باللويحات. يعد الكشف عن التركيب الخلوي للشريان السباتي على مستوى الخلية الواحدة أمرا ضروريا لعلاج تصلب الشرايين السباتي. ومع ذلك ، لا يوجد بروتوكول جاهز للاستخدام لإعداد معلقات أحادية الخلية من الشرايين السباتية. للحصول على بروتوكول مناسب لتفكك الشرايين السباتية الطبيعية على مستوى الخلية الواحدة مع ضرر أقل للخلايا ، قمنا بتصميم طريقة هضم من خطوتين من خلال دمج عملية هضم كولاجيناز / DNase والتريبسين. تم استخدام حساب التألق المزدوج لأكريدين أورانج / بروبيديوم يوديد (AO / PI) للكشف عن صلاحية الخلية وتركيزها ، ووجد أن التعليق أحادي الخلية يفي بمتطلبات تسلسل الخلية الواحدة ، مع صلاحية الخلايا أكثر من 85٪ وتركيز عال للخلية. بعد معالجة البيانات أحادية الخلية ، تم الكشف عن متوسط ~ 2500 نسخة لكل خلية في كل خلية شريان سباتي. والجدير بالذكر أن مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا في الشريان السباتي الطبيعي ، بما في ذلك خلايا العضلات الملساء الوعائية (VSMCs) ، والخلايا الليفية ، والخلايا البطانية (ECs) ، والبلاعم والخلايا المتغصنة (Mφ / DCs) ، كانت قابلة للاكتشاف في وقت واحد. يمكن تطبيق هذا البروتوكول لإعداد تعليق خلية واحدة للأوعية الدموية من الأنسجة الأخرى مع التعديلات المناسبة.
Introduction
تصلب الشرايين هو مرض التهابي مزمن يرتبط بعوامل الخطر مثل ارتفاع ضغط الدم وفرط شحميات الدم وديناميكا الدم1. تشعبات الشريان السباتي عرضة للتغيرات الديناميكية الدموية وتؤدي إلى تكوين اللويحات السباتية. يمكن أن يكون العرض السريري لتصلب الشرايين السباتي حادا مثل السكتة الدماغية ونقص التروية الدماغية العابرة ، أو مزمنا مثل نقص التروية الدماغية العابر المتكرر والخرف الوعائي2. ميكانيكيا ، اللويحة السباتية هي نتيجة التفاعل بين خلايا جدار الأوعية الدموية المختلفة وخلايا الدم المختلفة في ظل الظروف المرضية. لذلك ، فإن الكشف عن أطلس الخلية الواحدة للأوعية السباتية في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية مهم بشكل خاص لمنع وعلاج تطور البلاك السباتي.
يعد تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية أحد أقوى تقنيات البحث البيولوجي بسبب دقته الفائقة والكشف عن عدم تجانس الخلية من نفس نوع الخلية من الكائنات الحية 3,4. استخدم الباحثون تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لإجراء البحوث في العديد من المجالات ، مثل أمراض القلب والأوعية الدموية5 والسرطان6. ومع ذلك ، لا يزال فصل الأنسجة بسرعة ودقة إلى خلايا مفردة أحد التحديات الرئيسية. التفكك الأنزيمي هو طريقة شائعة الاستخدام تشمل في الغالب كولاجيناز ، غراء ، تربسين ، DNase ، وهيالورونيداز. على وجه التحديد ، الكولاجين هي أنواع الإنزيمات الرئيسية لعملية الهضم أحادية الخلية ، وخاصة مكونات الكولاجين المائية في الأنسجة الضامة. أنواع مختلفة من الكولاجين قابلة للتطبيق لتفكك الأنسجة المختلفة ، مثل الغدة الثديية7 ، الكبيبة8 ، زاوية القزحيةالقرنية 9 ، مفصل الركبة 10 ، الشريان الأورطي11 ، والرئة12. نظرا للخصائص الفسيولوجية الفريدة للأنسجة المختلفة ، قد يسبب التفكك باستخدام نفس الطريقة العديد من المشاكل في الحصول على خلايا مفردة ، مثل انخفاض صلاحية الخلية ، وانخفاض عدد الخلايا ، وحطام الخلايا الكبيرة. لذلك ، فإن اختراع طرق الهضم للأنسجة المختلفة أمر ضروري لإعداد معلقات أحادية الخلية عالية الجودة.
يهدف هذا البروتوكول إلى تطوير طريقة هضم خلوية من خطوتين لإعداد معلق أحادي الخلية للشريان السباتي للفئران البرية. وفقا لخصائص الشريان السباتي ، قمنا بدمج كولاجيناز / إنزيم مع التربسين للحصول على معلق أحادي الخلية عالي الجودة للشريان السباتي للفأر لأن كولاجيناز يمكن أن يتحلل الكولاجين في الأنسجة السباتية ، والذي تم هضمه بواسطة التربسين في معلق أحادي الخلية. تم استخدام حساب التألق المزدوج لأكريدين أورانج / بروبيديوم يوديد (AO / PI) للكشف عن صلاحية الخلية وتركيزها ، ووجد أن التعليق أحادي الخلية يفي بمتطلبات تسلسل الخلية الواحدة ، مع صلاحية الخلايا أكثر من 85٪ وتركيز عال للخلية. بعد معالجة البيانات أحادية الخلية ، تم تحديد أربعة أنواع من الخلايا ، بما في ذلك خلايا العضلات الملساء الوعائية (VSMCs) ، والخلايا الليفية ، والخلايا البطانية (ECs) ، والبلاعم والخلايا المتغصنة (Mφ / DCs) ، في الشرايين السباتية الطبيعية للفأر بعد الهضم. مزايا هذا البروتوكول هي: 1) يمكن تحديد أنواع متعددة من الخلايا في الشريان السباتي ، 2) يتم الحفاظ على صلاحية الخلية بشكل جيد ، و 3) يمكن تكرارها بسهولة بدون معدات خاصة. هذا البروتوكول مناسب للباحثين المهتمين بدراسة تعدد الخلايا أحادية الخلية للشرايين السباتية للفأر. قد يكون هذا البروتوكول مفيدا أيضا في تفكك الأوعية الدموية الأخرى مع التعديلات المناسبة.
Protocol
Representative Results
Discussion
نقدم هنا بروتوكولا مفصلا لإعداد معلق أحادي الخلية عالي الجودة من الشريان السباتي للفئران البرية ، حيث تم إنشاء طريقة هضم من خطوتين تدمج عملية هضم كولاجيناز / DNase والتربسين. بعد فحص جودة التعليق أحادي الخلية ، وجدنا أنه يفي بمتطلبات تسلسل الخلية الواحدة ، مع صلاحية الخلايا أكثر من 85٪ وتركيز…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل بمنح من مؤسسة العلوم الطبيعية في الصين (82070450 إلى CT و 82170466 إلى L.Z.) وزمالة مؤسسة علوم ما بعد الدكتوراه الصينية (7121102223 إلى F.L.).
Materials
| 0.25% EDTA-free trypsin | Beyotime | C0205 | Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS. |
| 0.9% NaCl saline solution | Beyotime | ST341 | Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL |
| 1 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r009 | To perform cardiac perfusion |
| 1.5 mL centrifuge tubes | KIRGEN | KG2211W | To centrifuge the tissue piece and cell suspension |
| 20 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r013 | To perform cardiac perfusion |
| 40 µm cell strainer | JETBIOFIL | css010040 | To filter undigested tissue fragments |
| AO/PI kit | Hengrui Biological | RE010212 | To identify whether the cell is alive or dead |
| Automated cell counter | Countstar | Mira FL | To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells |
| Cell Ranger software | 10× Genomics | 3.0.2 | To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis |
| Chromium Single Cell 3'Reagent Kits v3 | 10× Genomics | 1000075 | To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension |
| Collagenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL |
| Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002140 | Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30088.03 | Termination of the digestion reaction |
| Hank's balanced salt solution | Gibco | 14175095 | Store at the room temperture |
| Heparin sodium salt | Solarbio Life Science | H8060 | Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002560 | Applied for spining down the tissues and cell pellets |
| NovaSeq 6000 | Illumina | N/A | Sequencer |
| Phosphate-buffered saline | Solarbio Life Science | P1000 | Used for cardiac perfusion and resuspension of cells |
| Seurat package- R | Satija Lab | 3.1.2 | To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data |
| Six-well cell culture plates | NEST | 703002 | Place the vascular tissue |
| Water bath | Jinghong | DK-S22 | Keep the digestion temperature at 37 °C |
Riferimenti
- Lee, D. -. Y., Chiu, J. -. J. Atherosclerosis and flow: roles of epigenetic modulation in vascular endothelium. Journal of Biomedical Science. 26 (1), 56 (2019).
- Libby, P., et al. Atherosclerosis. Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 56 (2019).
- Jovic, D., et al. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview. Clinical and Translational Medicine. 12 (3), e694 (2022).
- Li, F., et al. Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow. Cell Death Discovery. 7 (1), 180 (2021).
- Rohlenova, K., et al. Single-cell RNA sequencing maps endothelial metabolic plasticity in pathological angiogenesis. Cell Metabolism. 31 (4), 862.e14-877.e14 (2020).
- Ren, X., et al. Insights gained from single-cell analysis of immune cells in the tumor microenvironment. Annual Review of Immunology. 39, 583-609 (2021).
- Sun, H., Xu, X., Deng, C. Preparation of single epithelial cells suspension from mouse mammary glands. Bio-Protocol. 10 (4), e3530 (2020).
- Korin, B., Chung, J. -. J., Avraham, S., Shaw, A. S. Preparation of single-cell suspensions of mouse glomeruli for high-throughput analysis. Nature Protocols. 16 (8), 4068-4083 (2021).
- Thomson, B., Quaggin, S. Preparation of a single cell suspension from the murine iridocorneal angle. Bio-Protocol. 12 (10), e4426 (2022).
- Leale, D. M., et al. A two-stage digestion of whole murine knee joints for single-cell RNA sequencing. Osteoarthritis and Cartilage Open. 4 (4), 100321 (2022).
- Hu, D., Yin, C., Mohanta, S. K., Weber, C., Habenicht, A. J. R. Preparation of single-cell suspensions from mouse aorta. Bio-Protocol. 6 (11), e1832 (2016).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS dissociator. Journal of Visualized Experiments. 29, e1266 (2009).
- You, Y., et al. Benchmarking UMI-based single-cell RNA-seq preprocessing workflows. Genome Biology. 22 (1), 339 (2021).
- Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single-cell data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
- Depuydt, M. A. C., et al. Microanatomy of the human atherosclerotic plaque by single-cell transcriptomics. Circulation Research. 127 (11), 1437-1455 (2020).
- Gao, X. -. F., et al. Single-cell RNA sequencing of the rat carotid arteries uncovers potential cellular targets of neointimal hyperplasia. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 75152 (2021).
- Kumar, S., et al. Isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments. Journal of Visualized Experiments. 176, e63128 (2021).
