Fremstilling af en enkeltcellesuspension fra musehalspulsårer til enkeltcellesekventering

Summary

Her beskriver vi en to-trins cellefordøjelsesprotokol til fremstilling af en enkeltcellesuspension af musehalspulsårer.

Abstract

Carotidarterier er store blodkar i nakken, der leverer blod og ilt til hjernen, men carotisstenose opstår, når halspulsårerne er tilstoppet af plak. Afsløring af den cellulære sammensætning af halspulsåren på enkeltcelleniveau er afgørende for behandling af carotis aterosklerose. Der er imidlertid ingen brugsklar protokol til fremstilling af enkeltcellesuspensioner fra halspulsårer. For at opnå en passende protokol til dissociation af normale halspulsårer på enkeltcelleniveau med mindre skade på celler, designede vi en to-trins fordøjelsesmetode ved at integrere fordøjelsesprocessen af collagenase/DNase og trypsin. Acridin orange / propidiumiodid (AO / PI) dobbeltfluorescenstælling blev brugt til at detektere cellelevedygtighed og koncentration, og det blev fundet, at enkeltcellesuspensionen opfyldte kravene til enkeltcellesekventering med levedygtigheden af celler over 85% og en høj cellekoncentration. Efter enkeltcelle databehandling blev der påvist en median på ~ 2500 transkripter pr. Celle i hver halspulsårecelle. Især var en række celletyper af den normale halspulsåre, herunder vaskulære glatte muskelceller (VSMC’er), fibroblaster, endotelceller (EC’er) og makrofager og dendritiske celler (Mφ / DC’er), samtidig detekterbare. Denne protokol kan anvendes til fremstilling af en enkeltcellesuspension af blodkar fra andre væv med passende modifikationer.

Introduction

Åreforkalkning er en kronisk inflammatorisk sygdom forbundet med risikofaktorer som forhøjet blodtryk, hyperlipidæmi og hæmodynamik¹. Carotidarteriebifurkationer er tilbøjelige til hæmodynamiske ændringer og fører til dannelse af carotisplak. Den kliniske præsentation af carotis aterosklerose kan være akut såsom slagtilfælde og forbigående cerebral iskæmi eller kronisk såsom tilbagevendende forbigående cerebral iskæmi og vaskulær demens². Mekanisk er carotisplaque resultatet af interaktionen mellem forskellige karvægceller og forskellige blodlegemer under patologiske tilstande. Derfor er det særligt vigtigt at afsløre encelleatlaset af carotiskar under fysiologiske og patologiske tilstande for at forebygge og behandle udvikling af carotisplaque.

Enkeltcelle RNA-sekventering er en af de mest kraftfulde teknologier inden for biologisk forskning på grund af dens ultrahøje opløsning og påvisning af celleheterogenitet fra den samme celletype af organismer ^3,4. Forskere har brugt enkeltcelle RNA-sekventering til at udføre forskning på mange områder, såsom hjerte-kar-sygdomme⁵ og kræft⁶. Imidlertid er hurtig og præcis adskillelse af væv i enkeltceller stadig en af de største udfordringer. Enzymatisk dissociation er en almindeligt anvendt metode, der dominerende omfatter collagenase, papain, trypsin, DNase og hyaluronidase. Specifikt er collagenaser de vigtigste enzymarter til enkeltcellefordøjelse, hovedsageligt hydrolyserende kollagenkomponenter i bindevæv. Forskellige kollagenasetyper kan anvendes til dissociation af forskellige væv, såsom brystkirtlen⁷, glomerulus⁸, iridocorneal vinkel⁹, knæleddet 10, aorta¹¹ og lunge¹². På grund af de unikke fysiologiske egenskaber ved forskellige væv kan dissociation ved hjælp af samme metode forårsage mange problemer med at erhverve enkeltceller, såsom lav cellelevedygtighed, lavt celleantal og store celleaffald. Derfor er opfindelsen af fordøjelsesmetoder til forskellige væv afgørende for fremstilling af enkeltcellesuspensioner af høj kvalitet.

Denne protokol sigter mod at udvikle en to-trins cellefordøjelsesmetode til fremstilling af en enkeltcellesuspension af halspulsåren hos vildtypemus. I henhold til halspulsårens egenskaber kombinerede vi collagenase/DNase med trypsin for at opnå en højkvalitets enkeltcellesuspension af musens halspulsåre, fordi collagenase kan hydrolysere kollagen af halsvævene, som blev yderligere fordøjet af trypsin til en enkeltcellesuspension. Acridin orange / propidiumiodid (AO / PI) dobbeltfluorescenstælling blev brugt til at detektere cellelevedygtighed og koncentration, og det blev fundet, at enkeltcellesuspensionen opfyldte kravene til enkeltcellesekventering med levedygtigheden af celler over 85% og en høj cellekoncentration. Efter enkeltcelle databehandling blev fire celletyper, herunder vaskulære glatte muskelceller (VSMC’er), fibroblaster, endotelceller (EC’er) og makrofager og dendritiske celler (Mφ / DC’er), identificeret i normale musehalspulsårer efter fordøjelsen. Fordelene ved denne protokol er, at: 1) flere celletyper i halspulsåren kan identificeres, 2) cellelevedygtighed er velbevaret, og 3) det kan let gentages uden specielt udstyr. Denne protokol er velegnet til forskere, der er interesserede i at studere enkeltcelle multiomics af musens halspulsårer. Denne protokol kan også være nyttig i dissociation af andre blodkar med passende ændringer.

Protocol

Alle dyreforsøg, der er beskrevet nedenfor, blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee of Soochow University. 1. Reagenser og materialeforberedelse Brug 1x PBS uden calcium og magnesium og 2,5 U / ml heparinnatriumsalt til at forberede perfusionsopløsningen. Opbevares ved 4 °C og forkøles på is, når det anvendes. Forbered dissociationsreagens A, der indeholder 125 CDU/ml collagenase II og 60 E/ml DNase I, ved at fortynde 1250 CDU/ml …

Representative Results

Denne protokol beskriver en to-trins cellefordøjelsesmetode til fremstilling af en enkeltcellesuspension af musehalspulsårer (figur 1). Denne to-trins cellefordøjelsesmetode kombinerer collagenase/DNase med trypsin for effektivt at adskille musens karotidvaskulære væg for at opnå enkeltcellesuspensioner af høj kvalitet til enkeltcellesekventering. Efter dissociation blev cellekoncentrationen og cellelevedygtigheden beregnet af en automatiseret celletæller. Det lyse felt viste morfolo…

Discussion

Her giver vi en detaljeret protokol til fremstilling af en højkvalitets enkeltcellesuspension fra halspulsåren hos vildtypemus, hvor en to-trins fordøjelsesmetode, der integrerer fordøjelsesprocessen af collagenase/DNase og trypsin, blev konstrueret. Efter kvalitetskontrollen af enkeltcellesuspensionen fandt vi, at den opfyldte kravene til enkeltcellesekventering med cellernes levedygtighed over 85% og en høj cellekoncentration. Desuden blev en række celletyper i halspulsåren, herunder VSMC’er, fibroblaster, EC’er…

Materials

0.25% EDTA-free trypsin	Beyotime	C0205	Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS.
0.9% NaCl saline solution	Beyotime	ST341	Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL
1 mL syringes	SKJYLEAN	sk-r009	To perform cardiac perfusion
1.5 mL centrifuge tubes	KIRGEN	KG2211W	To centrifuge the tissue piece and cell suspension
20 mL syringes	SKJYLEAN	sk-r013	To perform cardiac perfusion
40 µm cell strainer	JETBIOFIL	css010040	To filter undigested tissue fragments
AO/PI kit	Hengrui Biological	RE010212	To identify whether the cell is alive or dead
Automated cell counter	Countstar	Mira FL	To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells
Cell Ranger software	10× Genomics	3.0.2	To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis
Chromium Single Cell 3'Reagent Kits v3	10× Genomics	1000075	To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension
Collagenase II	Sigma-Aldrich	C6885	Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL
Deoxyribonuclease I	Worthington	LS002140	Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL
Fetal bovine serum	HyClone	SH30088.03	Termination of the digestion reaction
Hank's balanced salt solution	Gibco	14175095	Store at the room temperture
Heparin sodium salt	Solarbio Life Science	H8060	Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002560	Applied for spining down the tissues and cell pellets
NovaSeq 6000	Illumina	N/A	Sequencer
Phosphate-buffered saline	Solarbio Life Science	P1000	Used for cardiac perfusion and resuspension of cells
Seurat package- R	Satija Lab	3.1.2	To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data
Six-well cell culture plates	NEST	703002	Place the vascular tissue
Water bath	Jinghong	DK-S22	Keep the digestion temperature at 37 °C