Préparation d’une suspension unicellulaire à partir d’artères carotides de souris pour le séquençage unicellulaire
Summary
Nous décrivons ici un protocole de digestion cellulaire en deux étapes pour la préparation d’une suspension unicellulaire des artères carotides de souris.
Abstract
Les artères carotides sont les principaux vaisseaux sanguins du cou qui fournissent du sang et de l’oxygène au cerveau, mais la sténose carotidienne se produit lorsque les artères carotides sont obstruées par la plaque. La mise en évidence de la composition cellulaire de l’artère carotide au niveau unicellulaire est essentielle pour traiter l’athérosclérose carotidienne. Cependant, il n’existe pas de protocole prêt à l’emploi pour la préparation de suspensions unicellulaires à partir des artères carotides. Afin d’obtenir un protocole approprié pour la dissociation des artères carotides normales au niveau unicellulaire avec moins de dommages aux cellules, nous avons conçu une méthode de digestion en deux étapes en intégrant le processus de digestion de la collagénase/DNase et de la trypsine. Le comptage par double fluorescence orange acridine/iodure de propidium (AO/PI) a été utilisé pour détecter la viabilité et la concentration cellulaires, et il a été constaté que la suspension unicellulaire répondait aux exigences du séquençage unicellulaire, avec une viabilité des cellules supérieure à 85 % et une concentration cellulaire élevée. Après le traitement des données sur une seule cellule, une médiane de ~2500 transcrits par cellule a été détectée dans chaque cellule de l’artère carotide. Notamment, une variété de types de cellules de l’artère carotide normale, y compris les cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC), les fibroblastes, les cellules endothéliales (CE) et les macrophages et les cellules dendritiques (Mφ / DC), étaient détectables simultanément. Ce protocole peut être appliqué pour préparer une suspension unicellulaire de vaisseaux sanguins provenant d’autres tissus avec les modifications appropriées.
Introduction
L’athérosclérose est une maladie inflammatoire chronique associée à des facteurs de risque tels que l’hypertension artérielle, l’hyperlipidémie et l’hémodynamique1. Les bifurcations de l’artère carotide sont sujettes à des changements hémodynamiques et entraînent la formation de plaques carotidiennes. La présentation clinique de l’athérosclérose carotidienne peut être aiguë comme un accident vasculaire cérébral et une ischémie cérébrale transitoire, ou chronique comme une ischémie cérébrale transitoire récurrente et une démence vasculaire2. Mécaniquement, la plaque carotidienne est le résultat de l’interaction entre différentes cellules de la paroi des vaisseaux et diverses cellules sanguines dans des conditions pathologiques. Par conséquent, la révélation de l’atlas unicellulaire des vaisseaux carotidiens dans des conditions physiologiques et pathologiques est particulièrement importante pour prévenir et traiter le développement de la plaque carotidienne.
Le séquençage de l’ARN unicellulaire est l’une des technologies les plus puissantes de la recherche biologique en raison de sa très haute résolution et de la détection de l’hétérogénéité cellulaire d’organismes d’un même type de cellule 3,4. Les chercheurs ont utilisé le séquençage de l’ARN unicellulaire pour mener des recherches dans de nombreux domaines, tels que les maladies cardiovasculaires5 et le cancer6. Cependant, la séparation rapide et précise des tissus en cellules individuelles reste l’un des principaux défis. La dissociation enzymatique est une méthode couramment utilisée qui comprend principalement la collagénase, la papaïne, la trypsine, la DNase et la hyaluronidase. Plus précisément, les collagénases sont les principales espèces enzymatiques pour la digestion unicellulaire, hydrolysant principalement les composants du collagène dans les tissus conjonctifs. Différents types de collagénase sont applicables pour la dissociation de différents tissus, tels que la glande mammaire7, le glomérule8, l’angle irido-cornéen9, l’articulation du genou10, l’aorte 11 et le poumon12. En raison des propriétés physiologiques uniques de différents tissus, la dissociation à l’aide de la même méthode peut causer de nombreux problèmes lors de l’acquisition de cellules individuelles, telles qu’une faible viabilité cellulaire, un faible nombre de cellules et de gros débris cellulaires. Par conséquent, l’invention de méthodes de digestion pour différents tissus est essentielle pour préparer des suspensions unicellulaires de haute qualité.
Ce protocole vise à développer une méthode de digestion cellulaire en deux étapes pour préparer une suspension unicellulaire de l’artère carotide de souris de type sauvage. Selon les caractéristiques de l’artère carotide, nous avons combiné la collagénase/DNase avec de la trypsine pour obtenir une suspension unicellulaire de haute qualité de l’artère carotide de la souris, car la collagénase peut hydrolyser le collagène des tissus carotides, qui a ensuite été digéré par la trypsine en une suspension unicellulaire. Le comptage par double fluorescence orange acridine/iodure de propidium (AO/PI) a été utilisé pour détecter la viabilité et la concentration cellulaires, et il a été constaté que la suspension unicellulaire répondait aux exigences du séquençage unicellulaire, avec une viabilité des cellules supérieure à 85 % et une concentration cellulaire élevée. Après le traitement des données sur une seule cellule, quatre types de cellules, y compris les cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC), les fibroblastes, les cellules endothéliales (CE) et les macrophages et les cellules dendritiques (Mφ / DC), ont été identifiés dans les artères carotides normales de souris après digestion. Les avantages de ce protocole sont les suivants : 1) plusieurs types de cellules dans l’artère carotide peuvent être identifiés, 2) la viabilité cellulaire est bien préservée et 3) il peut être facilement répété sans équipement spécial. Ce protocole convient aux chercheurs qui s’intéressent à l’étude de la multiomique unicellulaire des artères carotides de souris. Ce protocole peut également être utile dans la dissociation d’autres vaisseaux sanguins avec des modifications appropriées.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous fournissons ici un protocole détaillé pour la préparation d’une suspension unicellulaire de haute qualité à partir de l’artère carotide de souris de type sauvage, dans lequel une méthode de digestion en deux étapes intégrant le processus de digestion de la collagénase/DNase et de la trypsine a été construite. Après le contrôle de la qualité de la suspension unicellulaire, nous avons constaté qu’elle répondait aux exigences du séquençage unicellulaire, avec une viabilité des cellules supéri…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation des sciences naturelles de Chine (82070450 à C.T. et 82170466 à L.Z.) et par la bourse de la Fondation chinoise pour les sciences postdoctorales (7121102223 à F.L.).
Materials
| 0.25% EDTA-free trypsin | Beyotime | C0205 | Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS. |
| 0.9% NaCl saline solution | Beyotime | ST341 | Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL |
| 1 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r009 | To perform cardiac perfusion |
| 1.5 mL centrifuge tubes | KIRGEN | KG2211W | To centrifuge the tissue piece and cell suspension |
| 20 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r013 | To perform cardiac perfusion |
| 40 µm cell strainer | JETBIOFIL | css010040 | To filter undigested tissue fragments |
| AO/PI kit | Hengrui Biological | RE010212 | To identify whether the cell is alive or dead |
| Automated cell counter | Countstar | Mira FL | To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells |
| Cell Ranger software | 10× Genomics | 3.0.2 | To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis |
| Chromium Single Cell 3'Reagent Kits v3 | 10× Genomics | 1000075 | To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension |
| Collagenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL |
| Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002140 | Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30088.03 | Termination of the digestion reaction |
| Hank's balanced salt solution | Gibco | 14175095 | Store at the room temperture |
| Heparin sodium salt | Solarbio Life Science | H8060 | Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002560 | Applied for spining down the tissues and cell pellets |
| NovaSeq 6000 | Illumina | N/A | Sequencer |
| Phosphate-buffered saline | Solarbio Life Science | P1000 | Used for cardiac perfusion and resuspension of cells |
| Seurat package- R | Satija Lab | 3.1.2 | To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data |
| Six-well cell culture plates | NEST | 703002 | Place the vascular tissue |
| Water bath | Jinghong | DK-S22 | Keep the digestion temperature at 37 °C |
Riferimenti
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