Fremstilling av en enkeltcellesuspensjon fra musekaroten arterier for enkeltcellesekvensering

Summary

Her beskriver vi en to-trinns celle fordøyelse protokoll for å forberede en enkeltcelle suspensjon av mus carotis arterier.

Abstract

Carotisarterier er store blodkar i nakken som leverer blod og oksygen til hjernen, men carotisstenose oppstår når halspulsårene er tilstoppet av plakk. Å avsløre den cellulære sammensetningen av halspulsåren på enkeltcellenivå er avgjørende for behandling av aterosklerose av carotis. Imidlertid er det ingen klar til bruk protokoll for fremstilling av enkeltcellede suspensjoner fra karoten arterier. For å oppnå en egnet protokoll for dissosiasjon av normale halspulsårer på enkeltcellenivå med mindre skade på celler, designet vi en to-trinns fordøyelsesmetode ved å integrere fordøyelsesprosessen av kollagenase / DNase og trypsin. Akridin oransje / propidiumjodid (AO / PI) dual-fluorescens telling ble brukt til å oppdage cellens levedyktighet og konsentrasjon, og det ble funnet at enkeltcellesuspensjonen tilfredsstilte kravene til enkeltcellesekvensering, med levedyktigheten til celler over 85% og en høy cellekonsentrasjon. Etter encellet databehandling ble det påvist en median på ~2500 transkripsjoner per celle i hver halspulsårecelle. Spesielt var en rekke celletyper av den normale halspulsåren, inkludert vaskulære glatte muskelceller (VSMCs), fibroblaster, endotelceller (ECs) og makrofager og dendrittiske celler (Mφ / DCs), samtidig detekterbare. Denne protokollen kan anvendes for å forberede en encellesuspensjon av blodkar fra andre vev med passende modifikasjoner.

Introduction

Aterosklerose er en kronisk inflammatorisk sykdom assosiert med risikofaktorer som høyt blodtrykk, hyperlipidemi og hemodynamikk¹. Carotisarteriebifurkasjoner er utsatt for hemodynamiske forandringer og fører til dannelse av carotisplakk. Den kliniske presentasjonen av aterosklerose på carotis kan være akutt som hjerneslag og forbigående cerebral iskemi, eller kronisk som residiverende forbigående cerebral iskemi og vaskulær demens². Mekanisk er karoteplakk resultatet av samspillet mellom forskjellige karveggceller og forskjellige blodceller under patologiske forhold. Derfor er avsløring av enkeltcelleatlaset av karoten kar under fysiologiske og patologiske forhold spesielt viktig for å forebygge og behandle utvikling av carotisplakk.

Enkeltcelle RNA-sekvensering er en av de kraftigste teknologiene for biologisk forskning på grunn av sin ultrahøye oppløsning og påvisning av celleheterogenitet fra samme celletype^av organismer ^3,4. Forskere har brukt enkeltcelle RNA-sekvensering til å utføre forskning på mange felt, for eksempel kardiovaskulær sykdom⁵ og kreft⁶. Imidlertid er rask og nøyaktig separering av vev i enkeltceller fortsatt en av hovedutfordringene. Enzymatisk dissosiasjon er en vanlig metode som dominerende inkluderer kollagenase, papain, trypsin, DNase og hyaluronidase. Spesielt er kollagenaser de viktigste enzymartene for encellet fordøyelse, hovedsakelig hydrolyserende kollagenkomponenter i bindevev. Ulike kollagenasetyper gjelder for dissosiasjon av forskjellige vev, for eksempel brystkjertelen⁷, glomerulus⁸, iridocorneal vinkel⁹, kneledd 10, aorta¹¹ og lunge¹². På grunn av de unike fysiologiske egenskapene til forskjellige vev, kan dissosiasjon ved hjelp av samme metode forårsake mange problemer med å anskaffe enkeltceller, for eksempel lav celle levedyktighet, lavt cellenummer og store celleavfall. Derfor er oppfinnelsen av fordøyelsesmetoder for forskjellige vev avgjørende for fremstilling av høykvalitets enkeltcellesuspensjoner.

Denne protokollen tar sikte på å utvikle en to-trinns cellefordøyelsesmetode for å fremstille en enkeltcellesuspensjon av halspulsåren hos villtypemus. I henhold til egenskapene til halspulsåren kombinerte vi kollagenase/DNase med trypsin for å oppnå en høyverdig encellesuspensjon av musehalspulsåren fordi kollagenase kan hydrolysere kollagen i halspulsvevet, som videre ble fordøyd av trypsin til en encellesuspensjon. Akridin oransje / propidiumjodid (AO / PI) dual-fluorescens telling ble brukt til å oppdage cellens levedyktighet og konsentrasjon, og det ble funnet at enkeltcellesuspensjonen tilfredsstilte kravene til enkeltcellesekvensering, med levedyktigheten til celler over 85% og en høy cellekonsentrasjon. Etter enkeltcelledatabehandling ble fire celletyper, inkludert vaskulære glatte muskelceller (VSMCs), fibroblaster, endotelceller (ECs) og makrofager og dendrittiske celler (Mφ / DCs), identifisert i normale musekarotisarterier etter fordøyelse. Fordelene med denne protokollen er at: 1) flere celletyper i halspulsåren kan identifiseres, 2) celle levedyktighet er godt bevart, og 3) det kan lett gjentas uten spesialutstyr. Denne protokollen er egnet for forskere som er interessert i å studere enkeltcelle multiomikk av musens halspulsårer. Denne protokollen kan også være nyttig i dissosiasjon av andre blodkar med passende modifikasjoner.

Protocol

Alle dyreprosedyrer beskrevet nedenfor ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee of Soochow University. 1. Reagenser og forberedelse av materialer Bruk 1x PBS uten kalsium og magnesium og 2,5 U / ml heparinnatriumsalt for å forberede perfusjonsoppløsningen. Oppbevares ved 4 °C, og forkjøles på is når den brukes. Klargjør dissosiasjonsreagens A som inneholder 125 CDU/ml kollagenase II og 60 U/ml DNase I ved å fortynne 1250 CDU/ml ko…

Representative Results

Denne protokollen beskriver en to-trinns cellefordøyelsesmetode for fremstilling av encellesuspensjon av carotisarterier hos mus (figur 1). Denne to-trinns cellefordøyelsesmetoden kombinerer kollagenase / DNase med trypsin for effektivt å dissosiere musens carotisvaskulære vegg for å oppnå høykvalitets enkeltcellesuspensjoner for enkeltcellesekvensering. Etter dissosiasjon ble cellekonsentrasjonen og cellens levedyktighet beregnet av en automatisert celleteller. Det lyse feltet viste …

Discussion

Her gir vi en detaljert protokoll for fremstilling av en høyverdig enkeltcellesuspensjon fra halspulsåren hos villtypemus, der en to-trinns fordøyelsesmetode som integrerer fordøyelsesprosessen av kollagenase / DNase og trypsin ble konstruert. Etter kvalitetskontrollen av encellesuspensjonen fant vi at den tilfredsstilte kravene til enkeltcellesekvensering, med levedyktigheten til celler over 85% og en høy cellekonsentrasjon. Videre ble en rekke celletyper i halspulsåren, inkludert VSMC, fibroblaster, EC og Mφ / D…

Materials

0.25% EDTA-free trypsin	Beyotime	C0205	Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS.
0.9% NaCl saline solution	Beyotime	ST341	Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL
1 mL syringes	SKJYLEAN	sk-r009	To perform cardiac perfusion
1.5 mL centrifuge tubes	KIRGEN	KG2211W	To centrifuge the tissue piece and cell suspension
20 mL syringes	SKJYLEAN	sk-r013	To perform cardiac perfusion
40 µm cell strainer	JETBIOFIL	css010040	To filter undigested tissue fragments
AO/PI kit	Hengrui Biological	RE010212	To identify whether the cell is alive or dead
Automated cell counter	Countstar	Mira FL	To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells
Cell Ranger software	10× Genomics	3.0.2	To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis
Chromium Single Cell 3'Reagent Kits v3	10× Genomics	1000075	To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension
Collagenase II	Sigma-Aldrich	C6885	Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL
Deoxyribonuclease I	Worthington	LS002140	Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL
Fetal bovine serum	HyClone	SH30088.03	Termination of the digestion reaction
Hank's balanced salt solution	Gibco	14175095	Store at the room temperture
Heparin sodium salt	Solarbio Life Science	H8060	Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002560	Applied for spining down the tissues and cell pellets
NovaSeq 6000	Illumina	N/A	Sequencer
Phosphate-buffered saline	Solarbio Life Science	P1000	Used for cardiac perfusion and resuspension of cells
Seurat package- R	Satija Lab	3.1.2	To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data
Six-well cell culture plates	NEST	703002	Place the vascular tissue
Water bath	Jinghong	DK-S22	Keep the digestion temperature at 37 °C