Qui descriviamo un protocollo di digestione cellulare in due fasi per la preparazione di una sospensione unicellulare delle arterie carotidi di topo.
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Articolo metodologico
Preparazione di una sospensione unicellulare da arterie carotidi di topo per il sequenziamento di singole cellule
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le arterie carotidi sono i principali vasi sanguigni del collo che forniscono sangue e ossigeno al cervello, ma la stenosi carotidea si verifica quando le arterie carotidi sono ostruite dalla placca. Rivelare la composizione cellulare dell'arteria carotide a livello di singola cellula è essenziale per il trattamento dell'aterosclerosi carotidea. Tuttavia, non esiste un protocollo pronto all'uso per la preparazione di sospensioni unicellulari da arterie carotidi. Per ottenere un protocollo adatto per la dissociazione delle arterie carotidi normali a livello di singola cellula con meno danni alle cellule, abbiamo progettato un metodo di digestione in due fasi integrando il processo di digestione della collagenasi/DNasi e della tripsina. Per rilevare la vitalità e la concentrazione delle cellule è stato utilizzato il conteggio a doppia fluorescenza di arancia acridina/ioduro di propidio (AO/PI) ed è stato riscontrato che la sospensione a singola cellula soddisfaceva i requisiti per il sequenziamento a singola cellula, con una vitalità delle cellule superiore all'85% e un'elevata concentrazione cellulare. Dopo l'elaborazione dei dati di una singola cellula, è stata rilevata una mediana di ~2500 trascritti per cellula in ciascuna cellula dell'arteria carotide. In particolare, una varietà di tipi di cellule della normale arteria carotide, tra cui le cellule muscolari lisce vascolari (VSMC), i fibroblasti, le cellule endoteliali (EC) e i macrofagi e le cellule dendritiche (Mφ/DC), erano rilevabili contemporaneamente. Questo protocollo può essere applicato per preparare una sospensione unicellulare di vasi sanguigni di altri tessuti con opportune modifiche.
Introduzione
L'aterosclerosi è una malattia infiammatoria cronica associata a fattori di rischio come l'ipertensione, l'iperlipidemia e l'emodinamica1. Le biforcazioni dell'arteria carotide sono soggette a cambiamenti emodinamici e portano alla formazione di placche carotidi. La presentazione clinica dell'aterosclerosi carotidea può essere acuta, come ictus e ischemia cerebrale transitoria, o cronica, come ischemia cerebrale transitoria ricorrente e demenza vascolare2. Meccanicamente, la placca carotidea è il risultato dell'interazione tra diverse cellule della parete dei vasi e varie cellule del sangue in condizioni patologiche. Per....
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Protocollo
Tutte le procedure sugli animali descritte di seguito sono state approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università di Soochow.
1. Preparazione di reagenti e materiali
- Utilizzare 1x PBS senza calcio e magnesio e 2,5 U/mL di sale sodico di eparina per preparare la soluzione di perfusione. Conservare a 4 °C e preraffreddare su ghiaccio al momento dell'uso.
- Preparare il reagente di dissociazione A che contenga 125 CDU/mL collagenasi II e 60 U/mL DNasi I diluendo 1250 CDU/mL collagenasi II e 3000 U/mL DNasi I con HBSS. Conservare a 4 °C fino al momento dell'utilizzo. ....
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Risultati
Questo protocollo descrive un metodo di digestione cellulare in due fasi per la preparazione di una sospensione unicellulare di arterie carotidi di topo (Figura 1). Questo metodo di digestione cellulare in due fasi combina la collagenasi/DNasi con la tripsina per dissociare efficacemente la parete vascolare carotide del topo per ottenere sospensioni unicellulari di alta qualità per il sequenziamento di singole cellule. Dopo la dissociazione, la concentrazione cellulare e la vitalità cellular.......
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Discussione
Qui forniamo un protocollo dettagliato per la preparazione di una sospensione unicellulare di alta qualità dall'arteria carotide di topi wild-type, in cui è stato costruito un metodo di digestione in due fasi che integra il processo di digestione della collagenasi/DNasi e della tripsina. Dopo il controllo di qualità della sospensione a singola cellula, abbiamo scoperto che soddisfaceva i requisiti per il sequenziamento a singola cellula, con una vitalità delle cellule superiore all'85% e un'elevata concentrazione cellula.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Natural Science Foundation of China (82070450 a C.T. e 82170466 a L.Z.) e dalla borsa di studio della China Postdoctoral Science Foundation (7121102223 a F.L.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tripsina senza EDTA allo 0,25% | Beyotime | C0205 | Diluire 1 mL di tripsina priva di EDTA allo 0,25% in 1 mL di 1x PBS. |
| Soluzione salina di NaCl allo 0,9% | Beyotime | ST341 | Diluire la soluzione di eparina sodica in una concentrazione finale di 10 mg/mL |
| 1 mL siringhe | SKJYLEAN | sk-r009 | Per eseguire la perfusione cardiaca |
| Provette da centrifuga da 1,5 mL | KIRGEN | KG2211W | Per centrifugare il pezzo di tessuto e la sospensione cellulare |
| Siringhe da 20 mL | SKJYLEAN | sk-r013 | Per eseguire la perfusione cardiaca |
| 40 &; filtro cellulare m | JETBIOFIL | css010040 | Per filtrare frammenti di tessuto non digeriti |
| Kit AO/PI | Hengrui Biological | RE010212 | Per identificare se la cellula è viva o morta |
| Contatore di cellule automatizzato | Countstar Mira | FL | Per analizzare la morfologia cellulare e la vitalità cellulare delle cellule vascolari carotidei digerite |
| Software Cell Ranger | 10× Genomica | 3.0.2 | Per elaborare l'output di RNA-seq a singola cellula di cromo ed eseguire il clustering e l'analisi dell'espressione genica |
| Kit di reagenti a singola cellula di cromo 3 v3 | 10× Genomica | 1000075 | Preparare librerie di RNA-seq a cellula singola di sospensione a cellula singola |
| Collagenasi II | Sigma-Aldrich | C6885 | Diluire con HBSS a una concentrazione finale di 125 CDU/mL |
| Desossiribonucleasi I | Worthington | LS002140 | Diluire con HBSS a una concentrazione finale di 60 U/mL |
| Siero bovino fetale | HyClone | SH30088.03 | Terminazione della reazione di digestione |
| Soluzione salina bilanciata di Hank | Gibco | 14175095 | Conservare a temperatura ambiente |
| Eparina sale sodico | Solarbio Life Science | H8060 | Diluire con 0,9% di NaCl ad una concentrazione finale di 10 mg/mL |
| Microcentrifuga | Thermo Fisher Scientific | 75002560 | Applicato per la centrifuga dei tessuti e dei pellet cellulari |
| NovaSeq 6000 | Illumina | N/A | Sequencer |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | Solarbio Life Science | P1000 | Utilizzato per la perfusione cardiaca e la risospensione delle cellule |
| Pacchetto Seurat - R | Satija Lab | 3.1.2 | Per eseguire la riduzione della dimensionalità, la visualizzazione e l'analisi dei dati di sequenziamento dello scRNA |
| Piastre per colture cellulari a sei pozzetti | NEST | 703002 | Posizionare il tessuto vascolare |
| Bagno d'acqua | Jinghong | DK-S22 | Mantenere la temperatura di digestione a 37 gradi E |
Riferimenti
- Lee, D. -Y., Chiu, J. -J. Atherosclerosis and flow: roles of epigenetic modulation in vascular endothelium. Journal of Biomedical Science. 26 (1), 56(2019).
- Libby, P., et al. Atherosclerosis. Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 56(2019). ....
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Ristampe e permessi
