Beredning av en encellssuspension från mössens halspulsådror för encellssekvensering

Summary

Här beskriver vi ett tvåstegs cellmatsmältningsprotokoll för att förbereda en encellssuspension av musens halspulsåder.

Abstract

Halspulsådrorna är stora blodkärl i halsen som förser hjärnan med blod och syre, men karotisstenos uppstår när halspulsådrorna täpps till av plack. Att avslöja den cellulära sammansättningen av halspulsådern på encellsnivå är viktigt för behandling av karotisateroskleros. Det finns dock inget färdigt protokoll för beredning av encellssuspensioner från halspulsådern. För att få ett lämpligt protokoll för dissociation av normala halspulsådror på encellsnivå med mindre skador på cellerna, utformade vi en tvåstegs matsmältningsmetod genom att integrera matsmältningsprocessen av kollagenas/DNas och trypsin. Dubbelfluorescensräkning av akridinorange/propidiumjodid (AO/PI) användes för att detektera cellviabilitet och koncentration, och det visade sig att encellssuspensionen uppfyllde kraven för encellssekvensering, med cellviabilitet över 85 % och en hög cellkoncentration. Efter databehandling med en cell detekterades en median på ~2500 transkript per cell i varje halspulsådercell. Noterbart är att en mängd olika celltyper i den normala halspulsådern, inklusive vaskulära glatta muskelceller (VSMC), fibroblaster, endotelceller (EC) och makrofager och dendritiska celler (Mφ/DC), kunde detekteras samtidigt. Detta protokoll kan användas för att bereda en encellssuspension av blodkärl från andra vävnader med lämpliga modifieringar.

Introduction

Åderförkalkning är en kronisk inflammatorisk sjukdom förknippad med riskfaktorer som högt blodtryck, hyperlipidemi och hemodynamik¹. Halspulsåderns förgreningar är benägna att drabbas av hemodynamiska förändringar och leder till att plack bildas i halspulsådern. Den kliniska presentationen av karotisateroskleros kan vara akut såsom stroke och övergående cerebral ischemi, eller kronisk såsom återkommande övergående cerebral ischemi och vaskulär demens². Mekaniskt är karotisplack resultatet av interaktionen mellan olika kärlväggsceller och olika blodceller under patologiska förhållanden. Därför är det särskilt viktigt att avslöja den encelliga atlasen över karotiskärl under fysiologiska och patologiska förhållanden för att förebygga och behandla utvecklingen av karotisplack.

Encells-RNA-sekvensering är en av de mest kraftfulla teknikerna inom biologisk forskning på grund av dess ultrahöga upplösning och detektion av cellheterogenitet från samma celltyp av organismer ^3,4. Forskare har använt encells-RNA-sekvensering för att bedriva forskning inom många områden, till exempel hjärt-kärlsjukdom⁵ och cancer⁶. Att snabbt och exakt separera vävnader till enskilda celler är dock fortfarande en av de största utmaningarna. Enzymatisk dissociation är en vanligt förekommande metod som främst inkluderar kollagenas, papain, trypsin, DNas och hyaluronidas. Kollagenaser är de viktigaste enzymerna för encellig matsmältning, främst hydrolyserande kollagenkomponenter i bindväv. Olika kollagenastyper är tillämpliga för dissociation av olika vävnader, såsom bröstkörteln⁷, glomerulus⁸, iridohornhinnans vinkel⁹, knäled 10, aorta¹¹ och lunga¹². På grund av de unika fysiologiska egenskaperna hos olika vävnader kan dissociation med samma metod orsaka många problem med att förvärva enstaka celler, såsom låg cellviabilitet, lågt cellantal och stora cellrester. Därför är uppfinningen av matsmältningsmetoder för olika vävnader avgörande för att framställa högkvalitativa encellssuspensioner.

Detta protokoll syftar till att utveckla en tvåstegs cellsmältningsmetod för att förbereda en encellssuspension av halspulsådern hos vildtypsmöss. Enligt egenskaperna hos halspulsådern kombinerade vi kollagenas/DNas med trypsin för att få en högkvalitativ encellssuspension av mössens halspulsåder eftersom kollagenas kan hydrolysera kollagen i halspulsådern, som smältes vidare av trypsin till en encellssuspension. Dubbelfluorescensräkning av akridinorange/propidiumjodid (AO/PI) användes för att detektera cellviabilitet och koncentration, och det visade sig att encellssuspensionen uppfyllde kraven för encellssekvensering, med cellviabilitet över 85 % och en hög cellkoncentration. Efter databehandling med enskilda celler identifierades fyra celltyper, inklusive vaskulära glatta muskelceller (VSMC), fibroblaster, endotelceller (EC) och makrofager och dendritiska celler (Mφ/DC), i normala halspulsådror hos möss efter matsmältning. Fördelarna med detta protokoll är att: 1) flera celltyper i halspulsådern kan identifieras, 2) cellviabiliteten är väl bevarad och 3) den kan enkelt upprepas utan specialutrustning. Detta protokoll är lämpligt för forskare som är intresserade av att studera encelliga multiomiker i mössens halspulsåder. Detta protokoll kan också vara till hjälp vid dissociation av andra blodkärl med lämpliga modifieringar.

Protocol

Alla djurförsök som beskrivs nedan har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee vid Soochow University. 1. Reagenser och materialberedning Använd 1x PBS utan kalcium och magnesium och 2,5 E/ml heparinnatriumsalt för att bereda perfusionslösningen. Förvaras vid 4 °C och förkyls på is vid användning. Bered dissociationsreagens A som innehåller 125 CDU/ml kollagenas II och 60 E/ml DNas I genom att späda 1250 CDU/ml kollagenas II och…

Representative Results

Detta protokoll beskriver en tvåstegs cellnedbrytningsmetod för att bereda en encellssuspension av mössens halspulsådror (figur 1). Denna tvåstegs cellnedbrytningsmetod kombinerar kollagenas/DNas med trypsin för att effektivt dissociera musens karotiskärlvägg för att erhålla högkvalitativa encellssuspensioner för encellssekvensering. Efter dissociation beräknades cellkoncentrationen och cellviabiliteten med hjälp av en automatiserad cellräknare. Det ljusa fältet visade morfol…

Discussion

Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för beredning av en högkvalitativ encellssuspension från halspulsådern hos vildtypsmöss, där en tvåstegs matsmältningsmetod som integrerar matsmältningsprocessen av kollagenas/DNas och trypsin konstruerades. Efter kvalitetskontrollen av encellssuspensionen fann vi att den uppfyllde kraven för encellssekvensering, med en livskraft på över 85 % och en hög cellkoncentration. Dessutom upptäcktes en mängd olika celltyper i halspulsådern, inklusive VSMC, fibrobl…

Materials

0.25% EDTA-free trypsin	Beyotime	C0205	Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS.
0.9% NaCl saline solution	Beyotime	ST341	Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL
1 mL syringes	SKJYLEAN	sk-r009	To perform cardiac perfusion
1.5 mL centrifuge tubes	KIRGEN	KG2211W	To centrifuge the tissue piece and cell suspension
20 mL syringes	SKJYLEAN	sk-r013	To perform cardiac perfusion
40 µm cell strainer	JETBIOFIL	css010040	To filter undigested tissue fragments
AO/PI kit	Hengrui Biological	RE010212	To identify whether the cell is alive or dead
Automated cell counter	Countstar	Mira FL	To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells
Cell Ranger software	10× Genomics	3.0.2	To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis
Chromium Single Cell 3'Reagent Kits v3	10× Genomics	1000075	To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension
Collagenase II	Sigma-Aldrich	C6885	Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL
Deoxyribonuclease I	Worthington	LS002140	Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL
Fetal bovine serum	HyClone	SH30088.03	Termination of the digestion reaction
Hank's balanced salt solution	Gibco	14175095	Store at the room temperture
Heparin sodium salt	Solarbio Life Science	H8060	Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002560	Applied for spining down the tissues and cell pellets
NovaSeq 6000	Illumina	N/A	Sequencer
Phosphate-buffered saline	Solarbio Life Science	P1000	Used for cardiac perfusion and resuspension of cells
Seurat package- R	Satija Lab	3.1.2	To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data
Six-well cell culture plates	NEST	703002	Place the vascular tissue
Water bath	Jinghong	DK-S22	Keep the digestion temperature at 37 °C