Etablering af en fysiologisk human vaskulariseret mikrotumormodel til kræftforskning
Summary
Denne protokol præsenterer en fysiologisk relevant tumor-on-a-chip-model til at udføre grundlæggende og translationel human kræftforskning med høj kapacitet, fremme lægemiddelscreening, sygdomsmodellering og personaliserede medicinmetoder med en beskrivelse af belastnings-, vedligeholdelses- og evalueringsprocedurer.
Abstract
Mangel på validerede kræftmodeller, der rekapitulerer tumormikromiljøet i solide kræftformer in vitro , er fortsat en betydelig flaskehals for præklinisk kræftforskning og terapeutisk udvikling. For at overvinde dette problem har vi udviklet den vaskulariserede mikrotumor (VMT) eller tumorchip, et mikrofysiologisk system, der realistisk modellerer det komplekse humane tumormikromiljø. VMT dannes de novo inden for en mikrofluidisk platform ved samdyrkning af flere humane celletyper under dynamiske, fysiologiske strømningsbetingelser. Denne vævsmanipulerede mikrotumorkonstruktion inkorporerer et levende perfuseret vaskulært netværk, der understøtter den voksende tumormasse, ligesom nydannede kar gør in vivo. Det er vigtigt, at lægemidler og immunceller skal krydse endotellaget for at nå tumoren og modellere in vivo fysiologiske barrierer for terapeutisk levering og effektivitet. Da VMT-platformen er optisk gennemsigtig, kan billeddannelse i høj opløsning af dynamiske processer såsom immuncelleekstravasation og metastase opnås med direkte visualisering af fluorescerende mærkede celler i vævet. Endvidere bevarer VMT in vivo tumorheterogenitet, genekspressionssignaturer og lægemiddelresponser. Næsten enhver tumortype kan tilpasses platformen, og primære celler fra friske kirurgiske væv vokser og reagerer på lægemiddelbehandling i VMT, hvilket baner vejen for virkelig personlig medicin. Her skitseres metoderne til etablering af VMT og anvendelse af den til onkologisk forskning. Denne innovative tilgang åbner nye muligheder for at studere tumorer og lægemiddelresponser, hvilket giver forskere et kraftfuldt værktøj til at fremme kræftforskning.
Introduction
Kræft er fortsat et stort sundhedsproblem på verdensplan og er den næststørste dødsårsag i USA. For året 2023 alene forventer National Center for Health Statistics mere end 1.9 millioner nye kræfttilfælde og over 600,000 kræftdødsfald, der forekommer i USA1, hvilket fremhæver det presserende behov for effektive behandlingsmetoder. Men i øjeblikket får kun 5,1% af anticancerterapi, der går ind i kliniske forsøg, i sidste ende FDA-godkendelse. Lovende kandidaters manglende succes gennem kliniske forsøg kan delvis tilskrives brugen af ikke-fysiologiske modelsystemer, såsom 2D- og sfæroidkulturer, under præklinisk lægemiddeludvikling2. Disse klassiske kræftmodeller mangler væsentlige komponenter i tumormikromiljøet, såsom en stromal niche, associerede immunceller og perfuseret vaskulatur, som er nøgledeterminanter for terapeutisk resistens og sygdomsprogression. Således er et nyt modelsystem, der bedre efterligner det humane in vivo tumormikromiljø, nødvendigt for at forbedre den kliniske oversættelse af prækliniske fund.
Området for vævsteknik udvikler sig hurtigt og giver forbedrede metoder til at studere menneskelige sygdomme i laboratorieindstillinger. En væsentlig udvikling er fremkomsten af mikrofysiologiske systemer (MPS), også kendt som organchips eller vævschips, som er funktionelle, miniaturiserede menneskelige organer, der er i stand til at replikere sunde eller syge tilstande 3,4,5. Inden for denne sammenhæng er tumorchips, som er tredimensionelle mikrofluidisk-baserede in vitro humane tumormodeller, blevet udviklet til onkologisk forskning 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Disse avancerede modeller inkorporerer biokemiske og biofysiske signaler inden for et dynamisk tumormikromiljø, hvilket gør det muligt for forskere at studere tumoradfærd og reaktioner på behandlinger i en mere fysiologisk relevant sammenhæng. På trods af disse fremskridt har få grupper imidlertid med succes indarbejdet en levende, funktionel vaskulatur, især en, der selvmønstrer som reaktion på fysiologisk strømning 3,4,5,6. Inkluderingen af et funktionelt vaskulært netværk er afgørende, da det giver mulighed for modellering af fysiske barrierer, der påvirker lægemiddel- eller cellelevering, cellehoming til forskellige mikromiljøer og transendotelmigration af tumor-, stromale og immunceller. Ved at inkludere denne funktion kan tumorchippen bedre repræsentere de kompleksiteter, der observeres i di vivo-tumormikromiljøet.
For at imødekomme dette uopfyldte behov har vi udviklet en ny lægemiddelscreeningsplatform, der gør det muligt for mikrokarnetværk at danne sig i en mikrofluidisk enhed 8,9,10,11,12,13,14,15,16. Denne basisorganchipplatform, kaldet det vaskulariserede mikroorgan (VMO), kan tilpasses stort set ethvert organsystem for at replikere original vævsfysiologi til sygdomsmodellering, lægemiddelscreening og personlige medicinapplikationer. VMO’er etableres ved co-kultivering af endotelkolonidannende celleafledte endotelceller (ECFC-EC), HUVEC eller iPSC-EC (herefter EC) og flere stromale celler i kammeret, herunder normale humane lungefibroblaster (NHLF), som ombygger matrixen, og pericytter, der ombryder og stabiliserer karrene. VMO kan også etableres som et kræftmodelsystem ved co-kultivering af tumorceller med den tilhørende stroma for at skabe en vaskulariseret mikrotumor (VMT) 8,9,10,11,12,13 eller tumorchip, model. Gennem samdyrkning af flere celletyper i et dynamisk flowmiljø dannes perfunderede mikrovaskulære netværk de novo i enhedens vævskamre, hvor vaskulogenese reguleres nøje af interstitielle strømningshastigheder14,15. Medium drives gennem enhedens mikrofluidiske kanaler af et hydrostatisk trykhoved, der forsyner de omgivende celler i vævskammeret med næringsstoffer udelukkende gennem mikrobeholderne med en permeabilitetskoefficient på 1,2 x 10-7 cm / s, svarende til hvad der ses for kapillærer in vivo8.
Inkorporeringen af selvorganiserende mikrokar i VMT-modellen repræsenterer et betydeligt gennembrud, fordi det: 1) efterligner strukturen og funktionen af vaskulariserede tumormasser in vivo; 2) kan modellere vigtige trin i metastaser, herunder tumorendotel- og stromale celleinteraktioner; 3) etablerer fysiologisk selektive barrierer for levering af næringsstoffer og lægemidler, hvilket forbedrer farmaceutisk screening; og 4) tillader direkte vurdering af lægemidler med antiangiogene og antimetastatiske evner. Ved at replikere in vivo-levering af næringsstoffer, lægemidler og immunceller i et komplekst 3D-mikromiljø er VMO/VMT-platformen en fysiologisk relevant model, der kan bruges til at udføre lægemiddelscreening og studere kræft-, vaskulær- eller organspecifik biologi. Det er vigtigt, at VMT understøtter væksten af forskellige typer tumorer, herunder tyktarmskræft, melanom, brystkræft, glioblastom, lungekræft, peritoneal carcinomatose, kræft i æggestokkene og kræft i bugspytkirtlen 8,9,10,11,12,13. Ud over at være billig, let etableret og opstillet til eksperimenter med høj gennemstrømning, er den mikrofluidiske platform fuldt optisk kompatibel til billedanalyse i realtid af tumor-stromale interaktioner og respons på stimuli eller terapi. Hver celletype i systemet er mærket med en anden fluorescerende markør for at muliggøre direkte visualisering og sporing af celleadfærd gennem hele eksperimentet, hvilket skaber et vindue ind i det dynamiske tumormikromiljø. Vi har tidligere vist, at VMT mere trofast modellerer in vivo tumorvækst, arkitektur, heterogenitet, genekspressionssignaturer og lægemiddelresponser end standardkulturmodaliteter10. Det er vigtigt, at VMT understøtter vækst og undersøgelse af patientafledte celler, herunder kræftceller, som bedre modellerer patologien for modertumorerne end standard sfæroidkulturer og yderligere fremmer personlig medicinindsats11. Dette manuskript skitserer metoderne til etablering af VMT og viser dets anvendelighed til at studere humane kræftformer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Næsten hvert væv i kroppen modtager næringsstoffer og ilt gennem vaskulaturen, hvilket gør det til en kritisk komponent til realistisk sygdomsmodellering og lægemiddelscreening in vitro. Desuden er flere maligniteter og sygdomstilstande defineret ved vaskulær endoteldysfunktion og hyperpermeabilitet3. Især i kræft er tumorassocieret vaskulatur ofte dårligt perfuseret, forstyrret og utæt, hvilket fungerer som en barriere for terapeutisk og immuncellelevering til tumoren. Desuden …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker medlemmer af Dr. Christopher Hughes ‘laboratorium for deres værdsatte input til de beskrevne procedurer samt vores samarbejdspartnere i Dr. Abraham Lees laboratorium for deres hjælp med platformdesign og fabrikation. Dette arbejde blev støttet af følgende tilskud: UG3/UH3 TR002137, R61/R33 HL154307, 1R01CA244571, 1R01 HL149748, U54 CA217378 (CCWH) og TL1 TR001415 and W81XWH2110393 (SJH).
Materials
| Fabrication | |||
| (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane, 95% | Sigma-Aldrich | 175617-100G | |
| Greiner Bio-One μClear Bottom 96-well Polystyrene Microplates | Greiner Bio-One | 655096 | |
| Methanol ≥99.8% ACS | VWR Chemicals BDH | BDH1135-1LP | |
| MILTEX Sterile Disposable Biopsy Punch with Plunger, 1mm diameter, | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
| PDMS membrane | PAX Industries | HT-6240 | |
| Plasma Cleaner PDC-001 | Harrick Plasma | N/A | |
| Smooth-Cast 385 | Smooth-On | N/A | |
| SP Bel-Art Lab Companion Clear Polycarbonate Cabinet Style Vacuum Desiccator | Bel-Art | F42400-4031 | |
| Standard Lids with Condensation Rings, 96-well plate | VWR | 82050-827 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow | 4019862 | |
| Cell culture/Loading | |||
| BioTek Lionheart FX Automated Microscope | Agilent | CYT5MFAW | |
| CELLvo Human Endothelial Progenitor Cells | StemBioSys | N/A | |
| Collagen I, rat tail | Enzo Life Sciences | ||
| Collagenase from Clostridium histolyticum (type 4) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Corning Hank’s Balanced Salt Solution, 1X without calcium and magnesium | Corning | 21-021-CV | |
| Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | 10013CV | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Neta Scientific | SIAL-341573 | |
| Fibronectin human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (70kDa) | Sigma-Aldrich | FD70S-1G | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Hyaluronidase from sheep testes (type 4) | Sigma-Aldrich | H6254 | |
| Laminin Mouse Protein | Gibco | 23017015 | |
| Leica TCS SP8 | Leica | N/A | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| NHLF – Normal Human Lung Fibroblasts | Lonza | CC-2512 | |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | N/A | |
| Paraformaldehyde 4% in 0.1M Phosphate BufferSaline, pH 7.4 | Electron Microscopy Sciences | 15735-90-1L | |
| PBMCs – Peripheral blood mononuclear cells | Lonza | CC-2702 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Avantor Seradigm | 97068-091 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P10144 | |
| Quick-RNA Microprep Kit | Zymo Research | R1051 | |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T4648 | |
| Triton X-100 (Electrophoresis), | Fisher BioReagents | BP151-100 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Gibco | 12605028 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
| Vasculife | Lifeline Cell Technology | LL-0003 |
Riferimenti
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. Cancer statistics, 2023. CA Cancer J Clin. 73 (1), 17-48 (2023).
- Hachey, S. J., Hughes, C. C. W. Applications of tumor chip technology. Lab Chip. 18 (19), 2893-2912 (2018).
- Ewald, M. L., Chen, Y. H., Lee, A. P., Hughes, C. C. W. The vascular niche in next generation microphysiological systems. Lab Chip. 21 (17), 3615-3616 (2021).
- Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Vascularized microfluidic organ-chips for drug screening, disease models and tissue engineering. Curr Opin Biotechnol. 52, 116-123 (2018).
- Shirure, V. S., Hughes, C. C. W., George, S. C. Engineering vascularized organoid-on-a-chip models. Annu Rev Biomed Eng. 23, 141-167 (2021).
- Del Piccolo, N., et al. Tumor-on-chip modeling of organ-specific cancer and metastasis. Adv Drug Deliv Rev. 175, 113798 (2021).
- Sontheimer-Phelps, A., Hassell, B. A., Ingber, D. E. Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips. Nat Rev Cancer. 19 (2), 65-81 (2019).
- Sobrino, A., et al. 3D microtumors in vitro supported by perfused vascular networks. Sci Rep. 6, 31589 (2016).
- Phan, D. T. T., et al. A vascularized and perfused organ-on-a-chip platform for large-scale drug screening applications. Lab Chip. 17 (3), 511-520 (2017).
- Hachey, S. J., et al. An in vitro vascularized micro-tumor model of human colorectal cancer recapitulates in vivo responses to standard-of-care therapy. Lab Chip. 21 (7), 1333-1351 (2021).
- Hachey, S. J., et al. A Human Vascularized Micro-Tumor Model of Patient-Derived Colorectal Cancer Recapitulates Clinical Disease. Transl Res. 255, 97-108 (2023).
- Liu, Y., et al. Human in vitro vascularized micro-organ and micro-tumor models are reproducible organ-on-a-chip platforms for studies of anticancer drugs. Toxicology. 445, 152601 (2020).
- Jahid, S., et al. Structure-based Design of CDC42 Effector Interaction Inhibitors for the Treatment of Cancer. Cell Rep. 39 (4), 110760 (2022).
- Hsu, Y. H., Moya, M. L., Hughes, C. C. W., George, S. C., Lee, A. P. A microfluidic platform for generating large-scale nearly identical human microphysiological vascularized tissue arrays. Lab Chip. 13 (15), 2990-2998 (2013).
- Moya, M. L., Hsu, Y. H., Lee, A. P., Christopher, C. W. H., George, S. C. In vitro perfused human capillary networks. Tissue Eng – Part C: Methods. 19 (9), 730-737 (2013).
- Wang, X., et al. An on-chip microfluidic pressure regulator that facilitates reproducible loading of cells and hydrogels into microphysiological system platforms. Lab Chip. 16 (5), 868-876 (2016).
- Phan, D. T., et al. Blood-brain barrier-on-a-chip: Microphysiological systems that capture the complexity of the blood-central nervous system interface. Exp Biol Med. 242 (17), 1669-1678 (2017).
- Kurokawa, Y. K., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells for three-dimensional microphysiological systems. Tissue Eng Part C: Methods. 23 (8), 474-484 (2017).
- Romero-López, M., et al. Recapitulating the human tumor microenvironment: Colon tumor-derived extracellular matrix promotes angiogenesis and tumor cell growth. Biomaterials. 116, 118-129 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: Image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).
- Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS one. 6 (11), e27385 (2011).
- Corliss, B. A., et al. REAVER: A program for improved analysis of high-resolution vascular network images. Microcirculation. 27 (5), e12618 (2020).
- Urban, G., et al. Deep learning for drug discovery and cancer research: Automated analysis of vascularization images. IEEE/ACM Trans Comput Biol Bioinform. 16 (3), 1029-1035 (2019).
