कैंसर अनुसंधान के लिए एक शारीरिक मानव संवहनी माइक्रो-ट्यूमर मॉडल की स्थापना
Summary
यह प्रोटोकॉल उच्च-थ्रूपुट बुनियादी और अनुवाद संबंधी मानव कैंसर अनुसंधान करने के लिए एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक ट्यूमर-ऑन-ए-चिप मॉडल प्रस्तुत करता है, जो लोडिंग, रखरखाव और मूल्यांकन प्रक्रियाओं के विवरण के साथ दवा स्क्रीनिंग, रोग मॉडलिंग और व्यक्तिगत चिकित्सा दृष्टिकोण को आगे बढ़ाता है।
Abstract
इन विट्रो में ठोस कैंसर के ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को पुन: व्यवस्थित करने वाले मान्य कैंसर मॉडल की कमी प्रीक्लिनिकल कैंसर अनुसंधान और चिकित्सीय विकास के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा बनी हुई है। इस समस्या को दूर करने के लिए, हमने संवहनी माइक्रोट्यूमर (वीएमटी), या ट्यूमर चिप, एक माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम विकसित किया है जो वास्तविक रूप से जटिल मानव ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को मॉडल करता है। वीएमटी गतिशील, शारीरिक प्रवाह स्थितियों के तहत कई मानव कोशिका प्रकारों की सह-संस्कृति द्वारा एक माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म के भीतर डी नोवो बनाता है। इस ऊतक-इंजीनियर माइक्रो-ट्यूमर निर्माण में एक जीवित सुगंधित संवहनी नेटवर्क शामिल है जो बढ़ते ट्यूमर द्रव्यमान का समर्थन करता है जैसे नवगठित जहाजों विवो में करते हैं। महत्वपूर्ण रूप से, दवाओं और प्रतिरक्षा कोशिकाओं को ट्यूमर तक पहुंचने के लिए एंडोथेलियल परत को पार करना होगा, चिकित्सीय वितरण और प्रभावकारिता के लिए विवो शारीरिक बाधाओं में मॉडलिंग करना होगा। चूंकि वीएमटी प्लेटफॉर्म ऑप्टिकली पारदर्शी है, इसलिए प्रतिरक्षा सेल एक्सट्रावेशन और मेटास्टेसिस जैसी गतिशील प्रक्रियाओं की उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग ऊतक के भीतर फ्लोरोसेंटली लेबल वाली कोशिकाओं के प्रत्यक्ष दृश्य के साथ प्राप्त की जा सकती है। इसके अलावा, वीएमटी विवो ट्यूमर विषमता, जीन अभिव्यक्ति हस्ताक्षर और दवा प्रतिक्रियाओं में बरकरार है। वस्तुतः किसी भी ट्यूमर प्रकार को मंच पर अनुकूलित किया जा सकता है, और ताजा सर्जिकल ऊतकों से प्राथमिक कोशिकाएं बढ़ती हैं और वीएमटी में दवा उपचार का जवाब देती हैं, जिससे वास्तव में व्यक्तिगत दवा की ओर मार्ग प्रशस्त होता है। यहां, वीएमटी स्थापित करने और ऑन्कोलॉजी अनुसंधान के लिए इसका उपयोग करने के तरीकों को रेखांकित किया गया है। यह अभिनव दृष्टिकोण ट्यूमर और दवा प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए नई संभावनाएं खोलता है, शोधकर्ताओं को कैंसर अनुसंधान को आगे बढ़ाने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है।
Introduction
कैंसर दुनिया भर में एक प्रमुख स्वास्थ्य चिंता बनी हुई है और संयुक्त राज्य अमेरिका में मृत्यु का दूसरा प्रमुख कारण है। अकेले वर्ष 2023 के लिए, नेशनल सेंटर फॉर हेल्थ स्टैटिस्टिक्स ने अमेरिका1 में 1.9 मिलियन से अधिक नए कैंसर के मामलों और 600,000 से अधिक कैंसर से होने वाली मौतों का अनुमान लगाया है, जो प्रभावी उपचार दृष्टिकोणों की तत्काल आवश्यकता पर प्रकाश डालता है। हालांकि, वर्तमान में, नैदानिक परीक्षणों में प्रवेश करने वाले कैंसर विरोधी चिकित्सा विज्ञान के केवल 5.1% अंततः एफडीए अनुमोदन प्राप्त करते हैं। नैदानिक परीक्षणों के माध्यम से सफलतापूर्वक प्रगति करने के लिए होनहार उम्मीदवारों की विफलता आंशिक रूप से गैर-शारीरिक मॉडल सिस्टम, जैसे 2 डी और स्फेरॉइड संस्कृतियों के उपयोग के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है, प्रीक्लिनिकल दवा विकास2 के दौरान। इन शास्त्रीय कैंसर मॉडल में ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के आवश्यक घटकों की कमी होती है, जैसे कि स्ट्रोमल आला, संबद्ध प्रतिरक्षा कोशिकाएं, और सुगंधित वाहिका, जो चिकित्सीय प्रतिरोध और रोग की प्रगति के प्रमुख निर्धारक हैं। इस प्रकार, एक नया मॉडल सिस्टम जो विवो ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में मानव की बेहतर नकल करता है, प्रीक्लिनिकल निष्कर्षों के नैदानिक अनुवाद में सुधार करने के लिए आवश्यक है।
ऊतक इंजीनियरिंग का क्षेत्र तेजी से आगे बढ़ रहा है, प्रयोगशाला सेटिंग्स में मानव रोगों के अध्ययन के लिए बेहतर तरीके प्रदान करता है। एक महत्वपूर्ण विकास माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम (एमपीएस) का उद्भव है, जिसे अंग चिप्स या ऊतक चिप्स के रूप में भी जाना जाता है, जो कार्यात्मक, लघु मानव अंग हैं जो स्वस्थ या रोगग्रस्त स्थितियों 3,4,5 को दोहराने में सक्षम हैं। इस संदर्भ में, ट्यूमर चिप्स, जो इन विट्रो मानव ट्यूमर मॉडल में तीन आयामी माइक्रोफ्लुइडिक-आधारित हैं, ऑन्कोलॉजी अनुसंधान 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 के लिए विकसित किए गए हैं . ये उन्नत मॉडल एक गतिशील ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के भीतर जैव रासायनिक और बायोफिजिकल संकेतों को शामिल करते हैं, जिससे शोधकर्ताओं को ट्यूमर के व्यवहार और अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक संदर्भ में उपचार के प्रति प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने में सक्षम बनाता है। हालांकि, इन प्रगति के बावजूद, कुछ समूहों ने सफलतापूर्वक एक जीवित, कार्यात्मक वाहिका को शामिल किया है, विशेष रूप से एक जो शारीरिक प्रवाह 3,4,5,6 के जवाब में आत्म-पैटर्न है। एक कार्यात्मक संवहनी नेटवर्क का समावेश महत्वपूर्ण है क्योंकि यह भौतिक बाधाओं को मॉडलिंग करने की अनुमति देता है जो दवा या सेल डिलीवरी को प्रभावित करते हैं, अलग-अलग माइक्रोएन्वायरमेंट के लिए सेल होमिंग, और ट्यूमर, स्ट्रोमल और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के ट्रांसेंडोथेलियल माइग्रेशन। इस सुविधा को शामिल करके, ट्यूमर चिप इन विवो ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में देखी गई जटिलताओं का बेहतर प्रतिनिधित्व कर सकती है।
इस अपूर्ण आवश्यकता को पूरा करने के लिए, हमने एक उपन्यास दवा-स्क्रीनिंग प्लेटफ़ॉर्म विकसित किया है जो माइक्रो-पोत नेटवर्क को माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस 8,9,10,11,12,13,14,15,16 के भीतर बनाने में सक्षम बनाता है। यह बेस ऑर्गन चिप प्लेटफॉर्म, जिसे संवहनी सूक्ष्म अंग (वीएमओ) कहा जाता है, को रोग मॉडलिंग, ड्रग स्क्रीनिंग और व्यक्तिगत दवा अनुप्रयोगों के लिए मूल ऊतक शरीर क्रिया विज्ञान को दोहराने के लिए लगभग किसी भी अंग प्रणाली के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। वीएमओ को एंडोथेलियल कॉलोनी बनाने वाले सेल-व्युत्पन्न एंडोथेलियल कोशिकाओं (ईसीएफसी-ईसी), एचयूवीईसी या आईपीएससी-ईसी (इसके बाद ईसी), और कक्ष में कई स्ट्रोमल कोशिकाओं द्वारा स्थापित किया जाता है, जिसमें सामान्य मानव फेफड़े के फाइब्रोब्लास्ट (एनएचएलएफ) शामिल हैं, जो मैट्रिक्स को फिर से तैयार करते हैं, और पेरिसाइट्स जो जहाजों को लपेटते और स्थिर करते हैं। VMO को संवहनी माइक्रो-ट्यूमर (VMT)8,9,10,11,12,13, या ट्यूमर चिप, मॉडल बनाने के लिए संबंधित स्ट्रोमा के साथ ट्यूमर कोशिकाओं को सह-संवर्धन करके कैंसर मॉडल प्रणाली के रूप में भी स्थापित किया जा सकता है। एक गतिशील प्रवाह वातावरण में कई सेल प्रकार के सह-संस्कृति के माध्यम से, perfused microvascular नेटवर्क बारीकी से अंतरालीय प्रवाह दर 14,15 द्वारा विनियमित है, जहां vasculogenesis बारीकी से अंतरालीय प्रवाह दरद्वारा नियंत्रित किया जाता है, डिवाइस के ऊतक कक्षों में डे नोवो फार्म. मध्यम को हाइड्रोस्टेटिक दबाव सिर द्वारा डिवाइस के माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों के माध्यम से संचालित किया जाता है जो ऊतक कक्ष के आसपास की कोशिकाओं को विशेष रूप से सूक्ष्म वाहिकाओं के माध्यम से पोषक तत्वों के साथ आपूर्ति करता है, जिसमें 1.2 x 10-7 सेमी/एस के पारगम्यता गुणांक के साथ, विवो8 में केशिकाओं के लिए क्या देखा जाता है।
वीएमटी मॉडल में स्व-आयोजन सूक्ष्म जहाजों का समावेश एक महत्वपूर्ण सफलता का प्रतिनिधित्व करता है क्योंकि यह: 1) विवो में संवहनी ट्यूमर द्रव्यमान की संरचना और कार्य की नकल करता है; 2) मेटास्टेसिस के प्रमुख चरणों को मॉडल कर सकते हैं, जिसमें ट्यूमर-एंडोथेलियल और स्ट्रोमल सेल इंटरैक्शन शामिल हैं; 3) पोषक तत्व और दवा वितरण के लिए शारीरिक रूप से चयनात्मक बाधाओं को स्थापित करता है, दवा स्क्रीनिंग में सुधार; और 4) एंटी-एंजियोजेनिक और एंटी-मेटास्टेटिक क्षमताओं के साथ दवाओं के प्रत्यक्ष मूल्यांकन की अनुमति देता है। एक जटिल 3 डी माइक्रोएन्वायरमेंट में पोषक तत्वों, दवाओं और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विवो डिलीवरी की नकल करके, वीएमओ / वीएमटी प्लेटफॉर्म एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक मॉडल है जिसका उपयोग दवा स्क्रीनिंग करने और कैंसर, संवहनी या अंग-विशिष्ट जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। महत्वपूर्ण रूप से, वीएमटी विभिन्न प्रकार के ट्यूमर के विकास का समर्थन करता है, जिसमें कोलन कैंसर, मेलेनोमा, स्तन कैंसर, ग्लियोब्लास्टोमा, फेफड़ों का कैंसर, पेरिटोनियल कार्सिनोमैटोसिस, डिम्बग्रंथि के कैंसर और अग्नाशय के कैंसर 8,9,10,11,12,13 शामिल हैं। कम लागत वाली, आसानी से स्थापित, और उच्च थ्रूपुट प्रयोगों के लिए सरणी होने के अलावा, माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म ट्यूमर-स्ट्रोमल इंटरैक्शन के वास्तविक समय की छवि विश्लेषण और उत्तेजनाओं या चिकित्सीय प्रतिक्रिया के लिए पूरी तरह से वैकल्पिक रूप से संगत है। सिस्टम में प्रत्येक सेल प्रकार को एक अलग फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ लेबल किया जाता है ताकि पूरे प्रयोग में सेल व्यवहार के प्रत्यक्ष दृश्य और ट्रैकिंग की अनुमति मिल सके, जिससे गतिशील ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में एक खिड़की बन सके। हम पहले दिखाया है कि वीएमटी अधिक ईमानदारी से विवो ट्यूमर विकास में मॉडल, वास्तुकला, विषमता, जीन अभिव्यक्ति हस्ताक्षर, और मानक संस्कृति तौर-तरीकों10 की तुलना में दवा प्रतिक्रियाओं. महत्वपूर्ण बात, VMT विकास और कैंसर कोशिकाओं, जो बेहतर मानक अंडाकार संस्कृतियों की तुलना में माता पिता ट्यूमर की विकृति मॉडल और आगे व्यक्तिगत चिकित्सा के प्रयासों11 अग्रिम सहित रोगी-व्युत्पन्न कोशिकाओं के अध्ययन का समर्थन करता है. यह पांडुलिपि वीएमटी की स्थापना के तरीकों की रूपरेखा तैयार करती है, जो मानव कैंसर के अध्ययन के लिए इसकी उपयोगिता को प्रदर्शित करती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
शरीर में लगभग हर ऊतक वाहिका के माध्यम से पोषक तत्व और ऑक्सीजन प्राप्त करता है, जिससे यह यथार्थवादी रोग मॉडलिंग और इन विट्रो में दवा स्क्रीनिंग के लिए एक महत्वपूर्ण घटक बन जाता है। इसके अलावा, कई विकृ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम वर्णित प्रक्रियाओं में उनके मूल्यवान इनपुट के लिए डॉ क्रिस्टोफर ह्यूजेस की प्रयोगशाला के सदस्यों के साथ-साथ मंच डिजाइन और निर्माण के साथ उनकी सहायता के लिए डॉ अब्राहम ली की प्रयोगशाला में हमारे सहयोगियों को धन्यवाद देते हैं। इस काम को निम्नलिखित अनुदानों द्वारा समर्थित किया गया था: UG3/UH3 TR002137, R61/R33 HL154307, 1R01CA244571, 1R01 HL149748, U54 CA217378 (CCWH) और TL1 TR001415 और W81XWH2110393 (SJH)।
Materials
| Fabrication | |||
| (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane, 95% | Sigma-Aldrich | 175617-100G | |
| Greiner Bio-One μClear Bottom 96-well Polystyrene Microplates | Greiner Bio-One | 655096 | |
| Methanol ≥99.8% ACS | VWR Chemicals BDH | BDH1135-1LP | |
| MILTEX Sterile Disposable Biopsy Punch with Plunger, 1mm diameter, | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
| PDMS membrane | PAX Industries | HT-6240 | |
| Plasma Cleaner PDC-001 | Harrick Plasma | N/A | |
| Smooth-Cast 385 | Smooth-On | N/A | |
| SP Bel-Art Lab Companion Clear Polycarbonate Cabinet Style Vacuum Desiccator | Bel-Art | F42400-4031 | |
| Standard Lids with Condensation Rings, 96-well plate | VWR | 82050-827 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow | 4019862 | |
| Cell culture/Loading | |||
| BioTek Lionheart FX Automated Microscope | Agilent | CYT5MFAW | |
| CELLvo Human Endothelial Progenitor Cells | StemBioSys | N/A | |
| Collagen I, rat tail | Enzo Life Sciences | ||
| Collagenase from Clostridium histolyticum (type 4) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Corning Hank’s Balanced Salt Solution, 1X without calcium and magnesium | Corning | 21-021-CV | |
| Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | 10013CV | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Neta Scientific | SIAL-341573 | |
| Fibronectin human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (70kDa) | Sigma-Aldrich | FD70S-1G | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Hyaluronidase from sheep testes (type 4) | Sigma-Aldrich | H6254 | |
| Laminin Mouse Protein | Gibco | 23017015 | |
| Leica TCS SP8 | Leica | N/A | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| NHLF – Normal Human Lung Fibroblasts | Lonza | CC-2512 | |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | N/A | |
| Paraformaldehyde 4% in 0.1M Phosphate BufferSaline, pH 7.4 | Electron Microscopy Sciences | 15735-90-1L | |
| PBMCs – Peripheral blood mononuclear cells | Lonza | CC-2702 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Avantor Seradigm | 97068-091 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P10144 | |
| Quick-RNA Microprep Kit | Zymo Research | R1051 | |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T4648 | |
| Triton X-100 (Electrophoresis), | Fisher BioReagents | BP151-100 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Gibco | 12605028 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
| Vasculife | Lifeline Cell Technology | LL-0003 |
Riferimenti
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