암 연구를 위한 생리학적 인간 혈관화 미세종양 모델 확립
Summary
이 프로토콜은 생리학적으로 관련된 종양온어칩(tumor-on-a-chip) 모델을 제시하여 고처리량 기초 및 중개 인간 암 연구를 수행하고, 약물 스크리닝, 질병 모델링 및 로딩, 유지 관리 및 평가 절차에 대한 설명과 함께 맞춤형 의학 접근법을 발전시킵니다.
Abstract
시험관 내 고형암의 종양 미세환경을 재현하는 검증된 암 모델의 부족은 전임상 암 연구 및 치료제 개발에 있어 여전히 중요한 병목 현상으로 남아 있습니다. 이러한 문제를 극복하기 위해 복잡한 인간 종양 미세환경을 현실적으로 모델링하는 미세생리학적 시스템인 혈관화 미세종양(vascularized microtumor, VMT) 또는 종양 칩(tumor chip)을 개발했습니다. VMT는 역동적이고 생리적인 유동 조건에서 여러 인간 세포 유형을 공동 배양하여 미세유체 플랫폼 내에서 새로운 세포를 형성합니다. 이 조직 공학적 미세 종양 구조는 생체 내에서 새로 형성된 혈관과 마찬가지로 성장하는 종양 덩어리를 지원하는 살아있는 관류 혈관 네트워크를 통합합니다. 중요한 것은 약물과 면역 세포가 종양에 도달하기 위해 내피층을 통과해야 하며, 치료 전달 및 효능에 대한 생체 내 생리학적 장벽을 모델링해야 한다는 것입니다. VMT 플랫폼은 광학적으로 투명하기 때문에 조직 내에서 형광 표지된 세포를 직접 시각화하여 면역 세포 유출 및 전이와 같은 동적 과정에 대한 고해상도 이미징을 달성할 수 있습니다. 또한 VMT는 생체 내 종양 이질성, 유전자 발현 시그니처 및 약물 반응을 유지합니다. 거의 모든 유형의 종양을 플랫폼에 적용할 수 있으며, 신선한 수술 조직의 일차 세포가 VMT에서 성장하고 약물 치료에 반응하여 진정한 맞춤형 의학을 향한 길을 열었습니다. 여기에서는 VMT를 확립하고 종양학 연구에 활용하는 방법을 간략하게 설명합니다. 이 혁신적인 접근 방식은 종양 및 약물 반응 연구를 위한 새로운 가능성을 열어 연구자들에게 암 연구를 발전시킬 수 있는 강력한 도구를 제공합니다.
Introduction
암은 전 세계적으로 주요 건강 문제로 남아 있으며 미국에서는 두 번째로 큰 사망 원인입니다. 미국 국립보건통계센터(National Center for Health Statistics)는 2023년 한 해에만 미국에서 190만 건 이상의 새로운 암 사례와 60만 명 이상의 암 사망자가 발생할 것으로 예상하고있다 1 효과적인 치료 접근법의 시급한 필요성을 강조하고 있다. 그러나 현재 임상시험에 진입한 항암제 중 5.1%만이 FDA 승인을 받고 있다. 유망한 후보 물질이 임상시험을 성공적으로 진행하지 못하는 것은 전임상 약물 개발 과정에서 2D 및 스페로이드 배양과 같은 비생리학적 모델 시스템을 사용하기 때문일 수 있다2. 이러한 고전적 암 모델에는 치료 내성 및 질병 진행의 주요 결정 요인인 기질 틈새, 관련 면역 세포 및 관류된 혈관과 같은 종양 미세환경의 필수 구성 요소가 부족합니다. 따라서 전임상 결과의 임상 번역을 개선하기 위해 인간 생체 내 종양 미세환경을 더 잘 모방하는 새로운 모델 시스템이 필요합니다.
조직 공학 분야는 빠르게 발전하고 있으며, 실험실 환경에서 인간의 질병을 연구하기 위한 개선된 방법을 제공하고 있습니다. 한 가지 중요한 발전은 장기 칩 또는 조직 칩으로도 알려진 미세 생리학 시스템(MPS)의 출현으로, 이는 건강하거나 병든 상태를 복제할 수 있는 기능적이고 소형화된 인간 장기입니다 3,4,5. 이러한 맥락에서 3차원 미세유체 기반 체외 인간 종양 모델인 종양 칩이 종양학 연구를 위해 개발되었습니다 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . 이러한 고급 모델은 역동적인 종양 미세환경 내에서 생화학적 및 생물물리학적 단서를 통합하여 연구자들이 생리학적으로 보다 관련성이 높은 맥락에서 종양 행동과 치료에 대한 반응을 연구할 수 있도록 합니다. 그러나 이러한 발전에도 불구하고 살아 있고 기능적인 혈관 구조, 특히 생리적 흐름에 반응하여 자체 패턴을 만드는 혈관을 성공적으로 통합한 그룹은 거의 없습니다 3,4,5,6. 기능적 혈관 네트워크의 포함은 약물 또는 세포 전달, 뚜렷한 미세 환경으로의 세포 귀환, 종양, 기질 및 면역 세포의 경내피 이동에 영향을 미치는 물리적 장벽을 모델링할 수 있기 때문에 매우 중요합니다. 이 특징을 포함시킴으로써, 종양 칩은 생체 내 종양 미세환경에서 관찰되는 복잡성을 더 잘 표현할 수 있다.
이러한 미충족 수요를 해결하기 위해 당사는 미세유체 장치 8,9,10,11,12,13,14,15,16 내에서 미세 혈관 네트워크를 형성할 수 있는 새로운 약물 스크리닝 플랫폼을 개발했습니다. 혈관화된 미세장기(vascularized micro-organ, VMO)라고 하는 이 기본 장기 칩 플랫폼은 질병 모델링, 약물 스크리닝 및 맞춤형 의학 응용 분야를 위해 원래 조직 생리학을 복제하기 위해 거의 모든 장기 시스템에 적용할 수 있습니다. VMO는 내피 콜로니 형성 세포 유래 내피 세포(ECFC-EC), HUVEC 또는 iPSC-EC(이하 EC)와 챔버 내 여러 기질 세포(기질을 리모델링하는 정상 인간 폐 섬유아세포(NHLF)와 혈관을 감싸고 안정화하는 주피를 포함한 여러 기질 세포를 공동 배양하여 확립합니다. VMO는 또한 종양 세포를 관련 기질과 공동 배양하여 혈관화된 미세 종양(VMT)8,9,10,11,12,13 또는 종양 칩 모델을 생성함으로써 암 모델 시스템으로 확립될 수 있습니다. 동적 유동 환경에서 여러 세포 유형의 공동 배양을 통해 관류된 미세혈관 네트워크는 혈관 형성이 간질 유속14,15에 의해 밀접하게 조절되는 장치의 조직 챔버에서 de novo를 형성합니다. 배지는 생체 내 모세혈관에서 볼 수 있는 것과 유사한 1.2 x 10-7 cm/s의 투과성 계수로 미세 혈관을 통해서만 조직 챔버의 주변 세포에 영양분을 공급하는 정수압 헤드에 의해 장치의 미세유체 채널을 통해 구동됩니다 8.
VMT 모델에 자기 조직화 된 마이크로 혈관의 통합은 다음과 같은 이유로 중요한 돌파구를 나타냅니다 : 1) 생체 내에서 혈관 종양 덩어리의 구조와 기능을 모방합니다. 2) 종양-내피 및 기질 세포 상호 작용을 포함한 전이의 주요 단계를 모델링할 수 있습니다. 3) 영양소 및 약물 전달을 위한 생리학적 선택적 장벽을 설정하여 의약품 스크리닝을 개선합니다. 4) 항혈관신생 및 항전이성 기능이 있는 약물을 직접 평가할 수 있습니다. VMO/VMT 플랫폼은 복잡한 3D 미세환경에서 영양소, 약물 및 면역 세포의 생체 내 전달을 복제함으로써 약물 스크리닝을 수행하고 암, 혈관 또는 장기 특이적 생물학을 연구하는 데 사용할 수 있는 생리학적으로 관련된 모델입니다. 중요한 것은 VMT가 대장암, 흑색종, 유방암, 교모세포종, 폐암, 복막암, 난소암, 췌장암 등 다양한 유형의 종양의 성장을 지원한다는 것입니다 8,9,10,11,12,13. 미세유체 플랫폼은 비용이 저렴하고 쉽게 설정할 수 있으며 고처리량 실험을 위해 배열할 수 있을 뿐만 아니라 종양-기질 상호 작용 및 자극 또는 치료에 대한 반응의 실시간 이미지 분석을 위해 광학적으로 완벽하게 호환됩니다. 시스템의 각 세포 유형은 서로 다른 형광 마커로 표지되어 전체 실험에서 세포 행동을 직접 시각화하고 추적할 수 있어 동적 종양 미세환경을 들여다볼 수 있습니다. 우리는 이전에 VMT가 표준 배양 양식보다 생체 내 종양 성장, 구조, 이질성, 유전자 발현 시그니처 및 약물 반응을 더 충실하게 모델링한다는 것을 보여주었습니다10. 중요한 것은 VMT가 암세포를 포함한 환자 유래 세포의 성장과 연구를 지원하여 표준 스페로이드 배양보다 모종양의 병리학을 더 잘 모델링하고 맞춤형 의학 노력을 더욱 발전시킨다는 것입니다11. 이 원고는 VMT를 확립하는 방법을 간략하게 설명하고 인간 암 연구에 대한 유용성을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
신체의 거의 모든 조직은 혈관을 통해 영양분과 산소를 공급받기 때문에 체 외에서 사실적인 질병 모델링 및 약물 스크리닝에 중요한 구성 요소입니다. 또한, 여러 악성 종양 및 질병 상태는 혈관 내피 기능 장애와 과투과성으로 정의된다3. 특히, 암에서 종양 관련 혈관 조직은 종종 관류가 잘 되지 않고, 파괴되고, 누출되어 종양에 대한 치료 및 면역 세포 전달에 장벽으로…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
설명된 절차에 귀중한 의견을 제시해 주신 Christopher Hughes 박사 연구실 구성원과 플랫폼 설계 및 제작에 도움을 주신 Abraham Lee 박사 연구실의 협력자에게 감사드립니다. 이 작업은 UG3/UH3 TR002137, R61/R33 HL154307, 1R01CA244571, 1R01 HL149748, U54 CA217378(CCWH) 및 TL1 TR001415 및 W81XWH2110393(SJH)의 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| Fabrication | |||
| (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane, 95% | Sigma-Aldrich | 175617-100G | |
| Greiner Bio-One μClear Bottom 96-well Polystyrene Microplates | Greiner Bio-One | 655096 | |
| Methanol ≥99.8% ACS | VWR Chemicals BDH | BDH1135-1LP | |
| MILTEX Sterile Disposable Biopsy Punch with Plunger, 1mm diameter, | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
| PDMS membrane | PAX Industries | HT-6240 | |
| Plasma Cleaner PDC-001 | Harrick Plasma | N/A | |
| Smooth-Cast 385 | Smooth-On | N/A | |
| SP Bel-Art Lab Companion Clear Polycarbonate Cabinet Style Vacuum Desiccator | Bel-Art | F42400-4031 | |
| Standard Lids with Condensation Rings, 96-well plate | VWR | 82050-827 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow | 4019862 | |
| Cell culture/Loading | |||
| BioTek Lionheart FX Automated Microscope | Agilent | CYT5MFAW | |
| CELLvo Human Endothelial Progenitor Cells | StemBioSys | N/A | |
| Collagen I, rat tail | Enzo Life Sciences | ||
| Collagenase from Clostridium histolyticum (type 4) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Corning Hank’s Balanced Salt Solution, 1X without calcium and magnesium | Corning | 21-021-CV | |
| Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | 10013CV | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Neta Scientific | SIAL-341573 | |
| Fibronectin human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (70kDa) | Sigma-Aldrich | FD70S-1G | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Hyaluronidase from sheep testes (type 4) | Sigma-Aldrich | H6254 | |
| Laminin Mouse Protein | Gibco | 23017015 | |
| Leica TCS SP8 | Leica | N/A | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| NHLF – Normal Human Lung Fibroblasts | Lonza | CC-2512 | |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | N/A | |
| Paraformaldehyde 4% in 0.1M Phosphate BufferSaline, pH 7.4 | Electron Microscopy Sciences | 15735-90-1L | |
| PBMCs – Peripheral blood mononuclear cells | Lonza | CC-2702 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Avantor Seradigm | 97068-091 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P10144 | |
| Quick-RNA Microprep Kit | Zymo Research | R1051 | |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T4648 | |
| Triton X-100 (Electrophoresis), | Fisher BioReagents | BP151-100 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Gibco | 12605028 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
| Vasculife | Lifeline Cell Technology | LL-0003 |
Riferimenti
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