Perturbation de la barrière hémato-encéphalique de la souris par de petites vésicules extracellulaires provenant de placentas humains hypoxiques
Summary
Un protocole est présenté pour évaluer si les petits VE (sEVs) isolés à partir d’explants placentaires cultivés dans des conditions hypoxiques (modélisation d’un aspect de la prééclampsie) perturbent la barrière hémato-encéphalique chez les souris femelles adultes non gravides.
Abstract
Les complications cérébrovasculaires, y compris l’œdème cérébral et les accidents vasculaires cérébraux ischémiques et hémorragiques, constituent la principale cause de mortalité maternelle associée à la prééclampsie. Les mécanismes sous-jacents de ces complications cérébrovasculaires restent flous. Cependant, ils sont liés à un dysfonctionnement placentaire et à une perturbation de la barrière hémato-encéphalique (BHE). Néanmoins, la connexion entre ces deux organes distants est encore en cours de détermination. De plus en plus de preuves suggèrent que le placenta libère des molécules de signalisation, y compris des vésicules extracellulaires, dans la circulation maternelle. Les vésicules extracellulaires sont classées en fonction de leur taille, les petites vésicules extracellulaires (sEV de moins de 200 nm de diamètre) étant considérées comme des particules de signalisation critiques dans des conditions physiologiques et pathologiques. Dans la prééclampsie, il y a une augmentation du nombre de sEV circulants dans la circulation maternelle, dont la fonction de signalisation n’est pas bien comprise. Les sEV placentaires libérés lors de la prééclampsie ou de placentas de grossesse normaux exposés à l’hypoxie induisent un dysfonctionnement endothélial cérébral et une perturbation de la BHE. Dans ce protocole, nous évaluons si les sEVs isolés à partir d’explants placentaires cultivés dans des conditions hypoxiques (modélisation d’un aspect de la prééclampsie) perturbent la BHE in vivo.
Introduction
Environ 70 % des décès maternels dus à la prééclampsie, un syndrome de grossesse hypertensive caractérisé par une altération des processus de placentation, un dysfonctionnement endothélial systémique maternel et, dans les cas graves, une défaillance multiviscérale 1,2, sont associés à des complications cérébrovasculaires aiguës 3,4. La plupart des décès maternels surviennent dans les pays à revenu faible ou intermédiaire5. Cependant, les mécanismes sous-jacents ne sont pas encore clairs malgré la pertinence clinique et épidémiologique des complications cérébrovasculaires associées à la prééclampsie.
D’autre part, les vésicules extracellulaires (VE) (diamètre ~30-400 nm) sont des médiateurs essentiels de la communication intercellulaire entre les tissus et les organes, y compris l’interaction materno-placentaire6. En plus des protéines et des lipides à la surface externe, les VE transportent une cargaison à l’intérieur (protéines, ARN et lipides). Les VE peuvent être classés en (1) exosomes (diamètre ~50-150 nm, également appelés petits VE (sEV)), (2) VE moyens/grands et (3) corps apoptotiques, qui diffèrent par leur taille, leur biogenèse, leur contenu et leur fonction de signalisation potentielle. La composition des VE est déterminée par les cellules dont ils sont issus et le type de maladie7. Les VE dérivés de syncytiotrophoblastes expriment la phosphatase alcaline placentaire (PLAP)8,9, qui détecte les petites VE circulantes dérivées du placentaire (PDsEV) pendant la grossesse. De plus, le PLAP aide à discerner les changements dans la cargaison de PDsEVs et leurs effets sur la prééclampsie par rapport aux grossesses normotensives 10,11,12,13,14,15.
Le placenta a été reconnu comme le composant nécessaire dans la physiopathologie de la prééclampsie16 ou des complications cérébrales associées à cette maladie 17,18,19. Cependant, on ne sait pas comment cet organe éloigné pourrait induire des altérations de la circulation cérébrale. Étant donné que les sEV jouent un rôle central dans la communication de cellule à cellule en raison de leur capacité à transférer des composants bioactifs des cellules donneuses aux cellules receveuses 6,20,21, un nombre croissant d’études ont associé les sEV placentaires à la génération de dysfonction endothéliale maternelle 21,22,23,24, y compris les cellules endothéliales cérébrales 25,26chez les femmes atteintes de prééclampsie. Ainsi, la compromission de la fonction endothéliale cérébrale peut entraîner une perturbation de la barrière hémato-encéphalique (BHE), un composant essentiel dans les complications cérébrovasculaires associées à la prééclampsie 3,27.
Néanmoins, les résultats précliniques utilisant des vaisseaux cérébraux de rat exposés au sérum de femmes atteintes de prééclampsie28 ou des cellules endothéliales cérébrales humaines exposées au plasma de femmes atteintes de prééclampsie29 ont rapporté que le ou les facteurs circulants induisent une perturbation de la BHE. Malgré plusieurs candidats susceptibles de nuire à la BHE présente dans la circulation maternelle pendant la prééclampsie, tels que des taux élevés de cytokines pro-inflammatoires (c’est-à-dire le facteur de nécrose tumorale)18,28 ou de régulateurs vasculaires (c’est-à-dire le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF))29,30,31, ou des molécules oxydatives telles que les lipoprotéines oxydées (oxo-LDL)32,33, entre autres34, aucun d’entre eux n’établit de lien direct entre le placenta et la BHE. Récemment, des sEV isolés de placentas hypoxiques ont montré la capacité de perturber la BHE chez des souris femelles non gestantes25. Étant donné que les sEV placentaires peuvent être porteurs de la plupart des facteurs circulants énumérés avec la capacité de perturber la BHE, les sEV sont considérés comme des candidats appropriés pour connecter le placenta lésé, être le porteur de facteurs circulants nocifs et perturber la BHE dans la prééclampsie.
Ce protocole nous permet d’étudier si les sEVs isolés à partir d’explants placentaires cultivés dans des conditions hypoxiques peuvent perturber la BHE chez des souris femelles non gestantes afin de comprendre la physiopathologie des complications cérébrales au cours de la prééclampsie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette étude révèle de nouvelles informations sur les dommages potentiels résultant des sEV isolés d’explants placentaires cultivés dans des conditions hypoxiques sur la perturbation de la barrière hémato-encéphalique des rongeurs. Le mécanisme pathologique implique une réduction de CLND-5 dans la région postérieure du cerveau25.
Des études antérieures ont révélé que les sEV plasmatiques de personnes atteintes de prééclampsie induisent un dysfonctio…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier les chercheurs de GRIVAS Health pour leur précieuse contribution. De plus, les sages-femmes et le personnel clinique du service d’obstétrique et de gynécologie appartiennent à l’hôpital de Chillan, au Chili. Fondée par Fondecyt Regular 1200250.
Materials
| Adult mice brain slecer matrice 3D printed | Open access file | Adult mice | Adult mice brain slicer. Printed in PLA filament. |
| Anti β-Actin primary antibody | Sigma-Aldrich | Clon AC-74 | Antibody for loading control (Western blot) |
| Anti-Claudin5 primary antibody | Santa cruz Biotechnology | sc-374221 | Primary antibody for tight junction protein CLDN5 of mice BBB (Western blot) |
| BCA protein kit | Thermo Scientific | 23225 | Kit for measuring protein concentration |
| Culture media #200 500 mL | Thermo Fisher Scientific | m200500 | Culture media for placental explants |
| D180 CO2 incubator | RWD Life science | D180 | Standard incubator to estabilize explants and culture sEVs-Nor |
| Evans blue dye > 75% 10 g | Sigma-Aldrich | E2129.10G | Dye to analize blood brain barrier disruption IN VIVO |
| Fetal bovine serum 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Additive growth factor for culture media 200 |
| Himac Ultracentrifuge CP100NX | Himac eppendorf group | 5720410101 | Ultracentrifuge for condicioned media > 1,20,000 x g |
| ImageJ software | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Isoflurane x 100 mL | USP Baxter | 212-094 | Volatile inhalated anaesthesia agent for mice |
| Kit CellTiter 96 Non-radioactive | Promega | 0000105232 | In vitro assay for placental explants viability |
| Mouse IgG Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | MO 63103 | Secondary antibody for CLDN5 (western blot) |
| NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | 90278090 | Nanotracking analysis of particles from placental explants condicioned media |
| Paraformaldehide E 97% solution 500 mL | Thermo Fisher Scientific | A11313.22 | Fixative solution for brain tissue slices and intracardial perfusion (once diluted) |
| PBS 1 X pH 7.4 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Wash solution for placenta explants |
| Peniciline-streptomicine 100x 20 mL | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | Antiobiotics for placental explants culture media |
| ProOX C21 Cytocentric O2 and CO2 Subchamber Controller | BioSpherix | SCR_021131 | CO2 regulator to induce Hypoxia in sealed chamber for sEVs-Hyp |
| Sodium Thiopental 1 g | Chemie | 7061 | humanitarian euthanasia agent |
| Somnosuite low flow anesthesia system | Kent Scientifics | SS-01 | Isoflurane vaporizer for small rodents |
| Surgical Warming platform | Kent Scientifics | A41166 | Warming platform for mainteinance anesthesia in mice |
| Syringe Filters, Polytetrafluoroethylene (PTFE), Hydrophobic, 0.22 µm, Sterile, 25 mm | Southern labware | 10026 | Filtration of condicioned media harvested from placental explants |
| Tabletop High-Speed Micro Centrifuges HITACHI himac CT15E/CT15RE | Hitachi medical systems | 6020 | Serial centrifugations of condicioned media < 1,20, 000 x g |
| Trinocular stereomicroscope transmided and reflective light 10x-160x | Center Medical | 2597 | Stereomicroscope to register brain slices |
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