פרוטוקול מוצג כדי להעריך אם EVs קטנים (sEVs) שבודדו מצמחי שליה שגודלו בתרבית בתנאים היפוקסיים (מודל היבט אחד של רעלת הריון) משבשים את מחסום הדם-מוח אצל עכברות בוגרות שאינן הרות.
סיבוכים מוחיים, כולל בצקת מוחית ושבץ איסכמי ודימומי, מהווים את הגורם המוביל לתמותה אימהית הקשורה לרעלת הריון. המנגנונים הבסיסיים של סיבוכים מוחיים אלה עדיין אינם ברורים. עם זאת, הם קשורים לתפקוד לקוי של השליה ולהפרעה במחסום הדם-מוח (BBB). עם זאת, הקשר בין שני איברים מרוחקים אלה עדיין מתברר. עדויות הולכות וגדלות מצביעות על כך שהשליה משחררת מולקולות איתות, כולל שלפוחיות חוץ-תאיות, למחזור הדם של האם. שלפוחיות חוץ-תאיות מסווגות לפי גודלן, כאשר שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות (sEV בקוטר קטן מ-200 ננומטר) נחשבות לחלקיקי איתות קריטיים הן בתנאים פיזיולוגיים והן בתנאים פתולוגיים. ברעלת הריון, יש מספר מוגבר של sEV במחזור הדם האימהי, שפונקציית האיתות שלו אינה מובנת היטב. שליות שליה המשתחררות ברעלת הריון או שליות הריון רגילות החשופות להיפוקסיה גורמות לתפקוד לקוי של אנדותל המוח ולהפרעה ב- BBB. בפרוטוקול זה, אנו מעריכים אם sEVs שבודדו מצמחי שליה בתרבית בתנאים היפוקסיים (מודלים של היבט אחד של רעלת הריון) משבשים את BBB in vivo.
כ-70% ממקרי המוות של אימהות עקב רעלת הריון, תסמונת הריון עם יתר לחץ דם המאופיינת בתהליכי שליה לקויים, תפקוד לקוי של האנדותל המערכתי של האם, ובמקרים חמורים כשל רב-מערכתי 1,2, קשורים לסיבוכים חריפים של כלי דם במוח 3,4. רוב מקרי המוות של אמהות מתרחשים במדינות בעלות הכנסה נמוכה ובינונית5. עם זאת, המנגנונים הבסיסיים עדיין אינם ברורים למרות הרלוונטיות הקלינית והאפידמיולוגית של סיבוכים מוחיים הקשורים לרעלת הריון.
מצד שני, שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) (קוטר ~ 30-400 ננומטר) הן מתווכות חיוניות של תקשורת בין-תאית בין רקמות ואיברים, כולל אינטראקציה אימהית-שליה6. בנוסף לחלבונים ושומנים על פני השטח החיצוניים, כלי רכב חשמליים נושאים מטען פנימי (חלבונים, רנ”א ושומנים). ניתן לסווג כלי רכב חשמליים ל-(1) אקסוזומים (קוטר ~50-150 ננומטר, המכונים גם כלי רכב חשמליים קטנים (sEVs)), (2) רכבים חשמליים בינוניים/גדולים, ו-(3) גופים אפופטוטיים, הנבדלים זה מזה בגודל, בביוגנזה, בתוכן ובפונקציית האיתות הפוטנציאלית. הרכב כלי הרכב החשמליים נקבע על פי התאים שמהם הם מגיעים וסוג המחלה7. EVs שמקורם ב-Syncytiotrophoblast מבטאים phosphatase אלקליין שליה (PLAP)8,9, אשר מזהה EVs קטנים שמקורם בשליה (PDsEVs) בהריון. כמו כן, PLAP מסייע להבחין בשינויים במטען PDsEVs והשפעתם ברעלת הריון לעומת הריונות נורמוטנסיים 10,11,12,13,14,15.
השליה הוכרה כמרכיב הכרחי בפתופיזיולוגיה של רעלת הריון16 או סיבוכים מוחיים הקשורים למחלה זו 17,18,19. אולם לא ידוע כיצד איבר מרוחק זה עשוי לגרום לשינויים במחזור המוח. מאחר שכלי רכב חשמליים ממלאים תפקידים מרכזיים בתקשורת בין תאים בשל יכולתם להעביר רכיבים ביו-אקטיביים מתאים מתורם לתאמקבל 6,20,21, מספר גדל והולך של מחקרים קשרו sEV שליה עם יצירת תפקוד לקוי של אנדותל אימהי 21,22,23,24, כולל תאי אנדותל במוח 25,26אצל נשים עם רעלת הריון. לפיכך, הפגיעה בתפקוד האנדותל במוח עלולה להוביל להפרעה במחסום הדם-מוח (BBB), מרכיב קריטי בסיבוכים מוחיים הקשורים לרעלת הריון 3,27.
עם זאת, ממצאים פרה-קליניים שהשתמשו בכלי דם מוחיים של חולדות שנחשפו לסרום של נשים עם רעלת הריון28 או תאי אנדותל במוח אנושי שנחשפו לפלזמה של נשים עם רעלת הריון29 דיווחו כי גורמים במחזור הדם גורמים להפרעה ב- BBB. למרות מספר מועמדים בעלי פוטנציאל לפגוע ב- BBB הקיים במחזור הדם האימהי במהלך רעלת הריון, כגון רמות גבוהות של ציטוקינים מעודדי דלקת (כלומר, גורם נמק גידולי)18,28 או מווסתי כלי דם (כלומר, גורם גדילה אנדותל כלי דם (VEGF))29,30,31, או מולקולות חמצון כגון ליפופרוטאינים מחומצנים (oxo-LDL)32,33, בין היתר34אף אחד מהם לא יוצר קשר ישיר בין השליה לבין BBB., לאחרונה, sEV שבודדו משליות היפוקסיביות הראו את היכולת לשבש את BBB בעכברות לא הרות25. מכיוון שכלי שליה חשמליים עשויים לשאת את רוב הגורמים המחזוריים המפורטים עם היכולת לשבש את BBB, sEV נחשבים מועמדים מתאימים לחבר את השליה הפגועה, להיות נשא של גורמים מזיקים במחזור הדם, ולשבש את BBB ברעלת הריון.
פרוטוקול זה מאפשר לנו לחקור אם sEV שבודדו מצמחי שליה שגודלו בתרבית בתנאים היפוקסיים יכולים לשבש את מחסום הדם-מוח בעכברות שאינן הרות כפרוקסי להבנת הפתופיזיולוגיה של סיבוכים מוחיים במהלך רעלת הריון.
מחקר זה חושף תובנות חדשות לגבי נזק פוטנציאלי הנובע מ-sEV שבודדו מצמחי שליה שגודלו בתרבית בתנאים היפוקסיים על שיבוש מחסום הדם-מוח של מכרסמים. המנגנון הפתולוגי כולל הפחתה ב- CLND-5 באזור המוח האחורי25.
מחקרים קודמים גילו כי פלסמה-sEV מאנשים עם רעלת הריון גורמים לתפקוד ל?…
The authors have nothing to disclose.
המחברים רוצים להודות לחוקרים השייכים ל-GRIVAS Health על תרומתם רבת הערך. כמו כן, מיילדות וצוות קליני משירות המיילדות והגינקולוגיה שייכים לבית החולים דה צ’ילאן, צ’ילה. נוסדה על ידי Fondecyt Regular 1200250.
Adult mice brain slecer matrice 3D printed | Open access file | Adult mice | Adult mice brain slicer. Printed in PLA filament. |
Anti β-Actin primary antibody | Sigma-Aldrich | Clon AC-74 | Antibody for loading control (Western blot) |
Anti-Claudin5 primary antibody | Santa cruz Biotechnology | sc-374221 | Primary antibody for tight junction protein CLDN5 of mice BBB (Western blot) |
BCA protein kit | Thermo Scientific | 23225 | Kit for measuring protein concentration |
Culture media #200 500 mL | Thermo Fisher Scientific | m200500 | Culture media for placental explants |
D180 CO2 incubator | RWD Life science | D180 | Standard incubator to estabilize explants and culture sEVs-Nor |
Evans blue dye > 75% 10 g | Sigma-Aldrich | E2129.10G | Dye to analize blood brain barrier disruption IN VIVO |
Fetal bovine serum 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Additive growth factor for culture media 200 |
Himac Ultracentrifuge CP100NX | Himac eppendorf group | 5720410101 | Ultracentrifuge for condicioned media > 1,20,000 x g |
ImageJ software | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
Isoflurane x 100 mL | USP Baxter | 212-094 | Volatile inhalated anaesthesia agent for mice |
Kit CellTiter 96 Non-radioactive | Promega | 0000105232 | In vitro assay for placental explants viability |
Mouse IgG Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | MO 63103 | Secondary antibody for CLDN5 (western blot) |
NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | 90278090 | Nanotracking analysis of particles from placental explants condicioned media |
Paraformaldehide E 97% solution 500 mL | Thermo Fisher Scientific | A11313.22 | Fixative solution for brain tissue slices and intracardial perfusion (once diluted) |
PBS 1 X pH 7.4 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Wash solution for placenta explants |
Peniciline-streptomicine 100x 20 mL | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | Antiobiotics for placental explants culture media |
ProOX C21 Cytocentric O2 and CO2 Subchamber Controller | BioSpherix | SCR_021131 | CO2 regulator to induce Hypoxia in sealed chamber for sEVs-Hyp |
Sodium Thiopental 1 g | Chemie | 7061 | humanitarian euthanasia agent |
Somnosuite low flow anesthesia system | Kent Scientifics | SS-01 | Isoflurane vaporizer for small rodents |
Surgical Warming platform | Kent Scientifics | A41166 | Warming platform for mainteinance anesthesia in mice |
Syringe Filters, Polytetrafluoroethylene (PTFE), Hydrophobic, 0.22 µm, Sterile, 25 mm | Southern labware | 10026 | Filtration of condicioned media harvested from placental explants |
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges HITACHI himac CT15E/CT15RE | Hitachi medical systems | 6020 | Serial centrifugations of condicioned media < 1,20, 000 x g |
Trinocular stereomicroscope transmided and reflective light 10x-160x | Center Medical | 2597 | Stereomicroscope to register brain slices |