Alteración de la barrera hematoencefálica del ratón por pequeñas vesículas extracelulares de placentas humanas hipóxicas
Summary
Se presenta un protocolo para evaluar si los pequeños VE (sEV) aislados de explantes placentarios cultivados en condiciones hipóxicas (modelando un aspecto de la preeclampsia) alteran la barrera hematoencefálica en ratones hembra adultos no preñados.
Abstract
Las complicaciones cerebrovasculares, como el edema cerebral y el accidente cerebrovascular isquémico y hemorrágico, constituyen la principal causa de mortalidad materna asociada a la preeclampsia. Los mecanismos subyacentes de estas complicaciones cerebrovasculares siguen sin estar claros. Sin embargo, están relacionados con la disfunción placentaria y la alteración de la barrera hematoencefálica (BBB). Sin embargo, la conexión entre estos dos órganos distantes aún se está determinando. Cada vez hay más pruebas que sugieren que la placenta libera moléculas de señalización, incluidas vesículas extracelulares, en la circulación materna. Las vesículas extracelulares se clasifican según su tamaño, siendo las pequeñas vesículas extracelulares (sEVs de menos de 200 nm de diámetro) consideradas partículas críticas de señalización tanto en condiciones fisiológicas como patológicas. En la preeclampsia, hay un mayor número de EV circulantes en la circulación materna, cuya función de señalización no se comprende bien. Las EV placentarias liberadas en la preeclampsia o de placentas normales del embarazo expuestas a hipoxia inducen disfunción endotelial cerebral y alteración de la BHE. En este protocolo, evaluamos si los sEV aislados de explantes placentarios cultivados en condiciones hipóxicas (modelando un aspecto de la preeclampsia) alteran la BHE in vivo.
Introduction
Aproximadamente 70% de las muertes maternas debidas a preeclampsia, un síndrome de embarazo hipertensivo caracterizado por alteración de los procesos de placentación, disfunción endotelial sistémica materna y, en casos graves, falla multiorgánica 1,2, se asocian con complicaciones cerebrovasculares agudas 3,4. La mayoría de las muertes maternas ocurren en países de ingresos bajos y medianos5. Sin embargo, los mecanismos subyacentes aún no están claros a pesar de la relevancia clínica y epidemiológica de las complicaciones cerebrovasculares asociadas con la preeclampsia.
Por otro lado, las vesículas extracelulares (VE) (diámetro ~30-400 nm) son mediadores esenciales de la comunicación intercelular entre tejidos y órganos, incluyendo la interacción madre-placenta6. Además de las proteínas y los lípidos de la superficie externa, los VE transportan carga en su interior (proteínas, ARN y lípidos). Los VE se pueden clasificar en (1) exosomas (diámetro ~50-150 nm, también llamados VE pequeños (sEV)), (2) EV medianos/grandes y (3) cuerpos apoptóticos, que difieren por tamaño, biogénesis, contenido y función de señalización potencial. La composición de las VE está determinada por las células de las que proceden y por el tipo de enfermedad7. Las VE derivadas de sincitiotrofoblastos expresan fosfatasa alcalina placentaria (PLAP)8,9, que detecta pequeñas VE circulantes derivadas de placenta (PDsEV) en el embarazo. Además, el PLAP ayuda a discernir los cambios en la carga de PDsEVs y sus efectos en la preeclampsia versus embarazos normotensos 10,11,12,13,14,15.
La placenta ha sido reconocida como el componente necesario en la fisiopatología de la preeclampsia16 o complicaciones cerebrales asociadas a esta enfermedad 17,18,19. Sin embargo, se desconoce cómo este órgano distante podría inducir alteraciones en la circulación cerebral. Dado que los sEV desempeñan un papel fundamental en la comunicación de célula a célula debido a su capacidad para transferir componentes bioactivos de las células donantes a las receptoras 6,20,21, un número creciente de estudios han asociado los sEV placentarios con la generación de disfunción endotelial materna 21,22,23,24, incluidas las células endoteliales cerebrales 25,26en mujeres con preeclampsia. Por lo tanto, el compromiso de la función endotelial cerebral puede conducir a la alteración de la barrera hematoencefálica (BHE), un componente crítico en las complicaciones cerebrovasculares asociadas a la preeclampsia 3,27.
Sin embargo, los hallazgos preclínicos utilizando vasos cerebrales de rata expuestos al suero de mujeres con preeclampsia28 o células endoteliales cerebrales humanas expuestas al plasma de mujeres con preeclampsia29 informaron que los factores circulantes inducen la alteración de la BHE. A pesar de que existen varios candidatos con potencial para dañar la BHE presente en la circulación materna durante la preeclampsia, como niveles elevados de citocinas proinflamatorias (i.e., factor de necrosis tumoral)18,28 o reguladores vasculares (i.e., factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF))29,30,31, o moléculas oxidativas como las lipoproteínas oxidadas (oxo-LDL)32,33, entre otros34, ninguno de ellos establece una conexión directa entre la placenta y la BHE. Recientemente, los sEV aislados de placentas hipóxicas han demostrado la capacidad de alterar la barrera hematoencefálica en ratones hembra no preñados25. Dado que los SEV placentarios pueden transportar la mayoría de los factores circulantes enumerados con la capacidad de alterar la BHE, los SEV se consideran candidatos adecuados para conectar la placenta lesionada, ser portadores de factores circulantes dañinos y alterar la BHE en la preeclampsia.
Este protocolo nos permite investigar si los sEV aislados de explantes placentarios cultivados en condiciones hipóxicas pueden alterar la BHE en ratones hembra no preñados como un proxy para comprender la fisiopatología de las complicaciones cerebrales durante la preeclampsia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este estudio revela nuevos conocimientos sobre el daño potencial resultante de los sEV aislados de explantes placentarios cultivados en condiciones hipóxicas en la alteración de la barrera hematoencefálica de roedores. El mecanismo patológico implica una reducción de la CLND-5 en la región posterior del cerebro25.
Investigaciones previas han revelado que los plasma-sEVs de individuos con preeclampsia inducen disfunción endotelial en diversos órganos utilizando …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a los investigadores pertenecientes a GRIVAS Health su valiosa aportación. Asimismo, las parteras y el personal clínico del Servicio de Obstetricia y Ginecología pertenecen al Hospital de Chillán, Chile. Fundada por Fondecyt Regular 1200250.
Materials
| Adult mice brain slecer matrice 3D printed | Open access file | Adult mice | Adult mice brain slicer. Printed in PLA filament. |
| Anti β-Actin primary antibody | Sigma-Aldrich | Clon AC-74 | Antibody for loading control (Western blot) |
| Anti-Claudin5 primary antibody | Santa cruz Biotechnology | sc-374221 | Primary antibody for tight junction protein CLDN5 of mice BBB (Western blot) |
| BCA protein kit | Thermo Scientific | 23225 | Kit for measuring protein concentration |
| Culture media #200 500 mL | Thermo Fisher Scientific | m200500 | Culture media for placental explants |
| D180 CO2 incubator | RWD Life science | D180 | Standard incubator to estabilize explants and culture sEVs-Nor |
| Evans blue dye > 75% 10 g | Sigma-Aldrich | E2129.10G | Dye to analize blood brain barrier disruption IN VIVO |
| Fetal bovine serum 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Additive growth factor for culture media 200 |
| Himac Ultracentrifuge CP100NX | Himac eppendorf group | 5720410101 | Ultracentrifuge for condicioned media > 1,20,000 x g |
| ImageJ software | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Isoflurane x 100 mL | USP Baxter | 212-094 | Volatile inhalated anaesthesia agent for mice |
| Kit CellTiter 96 Non-radioactive | Promega | 0000105232 | In vitro assay for placental explants viability |
| Mouse IgG Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | MO 63103 | Secondary antibody for CLDN5 (western blot) |
| NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | 90278090 | Nanotracking analysis of particles from placental explants condicioned media |
| Paraformaldehide E 97% solution 500 mL | Thermo Fisher Scientific | A11313.22 | Fixative solution for brain tissue slices and intracardial perfusion (once diluted) |
| PBS 1 X pH 7.4 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Wash solution for placenta explants |
| Peniciline-streptomicine 100x 20 mL | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | Antiobiotics for placental explants culture media |
| ProOX C21 Cytocentric O2 and CO2 Subchamber Controller | BioSpherix | SCR_021131 | CO2 regulator to induce Hypoxia in sealed chamber for sEVs-Hyp |
| Sodium Thiopental 1 g | Chemie | 7061 | humanitarian euthanasia agent |
| Somnosuite low flow anesthesia system | Kent Scientifics | SS-01 | Isoflurane vaporizer for small rodents |
| Surgical Warming platform | Kent Scientifics | A41166 | Warming platform for mainteinance anesthesia in mice |
| Syringe Filters, Polytetrafluoroethylene (PTFE), Hydrophobic, 0.22 µm, Sterile, 25 mm | Southern labware | 10026 | Filtration of condicioned media harvested from placental explants |
| Tabletop High-Speed Micro Centrifuges HITACHI himac CT15E/CT15RE | Hitachi medical systems | 6020 | Serial centrifugations of condicioned media < 1,20, 000 x g |
| Trinocular stereomicroscope transmided and reflective light 10x-160x | Center Medical | 2597 | Stereomicroscope to register brain slices |
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