Viene presentato un protocollo per valutare se le piccole vescicole extracellulari (sEV) isolate da espianti placentari coltivati in condizioni ipossiche (modellando un aspetto della preeclampsia) interrompono la barriera emato-encefalica in topi femmine adulte non gravide.
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Articolo metodologico
Rottura della barriera emato-encefalica del topo da piccole vescicole extracellulari da placente umane ipossiche
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le complicanze cerebrovascolari, tra cui l'edema cerebrale e l'ictus ischemico ed emorragico, costituiscono la principale causa di mortalità materna associata alla preeclampsia. I meccanismi alla base di queste complicanze cerebrovascolari rimangono poco chiari. Tuttavia, sono collegati alla disfunzione placentare e all'interruzione della barriera emato-encefalica (BBB). Tuttavia, la connessione tra questi due organi distanti è ancora in fase di determinazione. Prove crescenti suggeriscono che la placenta rilascia molecole di segnalazione, comprese le vescicole extracellulari, nella circolazione materna. Le vescicole extracellulari sono classificate in base alle loro dimensioni, con piccole vescicole extracellulari (sEV di diametro inferiore a 200 nm) considerate particelle di segnalazione critiche sia in condizioni fisiologiche che patologiche. Nella preeclampsia, c'è un aumento del numero di sEV circolanti nella circolazione materna, la cui funzione di segnalazione non è ben compresa. Le sEV placentari rilasciate nella preeclampsia o dalle placente della gravidanza normale esposte all'ipossia inducono disfunzione endoteliale cerebrale e interruzione della BBB. In questo protocollo, valutiamo se le sEV isolate da espianti placentari coltivati in condizioni ipossiche (modellando un aspetto della preeclampsia) interrompono la BBB in vivo.
Introduzione
Circa il 70% dei decessi materni dovuti a preeclampsia, una sindrome gravidica ipertensiva caratterizzata da alterazione dei processi di placentazione, disfunzione endoteliale sistemica maternae, nei casi più gravi, insufficienza multiorgano 1,2, sono associati a complicanze cerebrovascolari acute 3,4. La maggior parte dei decessi materni si verifica nei paesi a basso e medio reddito5. Tuttavia, i meccanismi sottostanti non sono ancora chiari nonostante la rilevanza clinica ed epidemiologica delle complicanze cerebrovascolari as....
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Protocollo
La ricerca è stata condotta seguendo i principi espressi nella Dichiarazione di Helsinki e sotto l'autorizzazione dei rispettivi Comitati di Revisione Etica. Tutti i partecipanti umani hanno dato il loro consenso informato prima della raccolta del campione, come riportato in precedenza25. Inoltre, il Comitato per la Bioetica e la Biosicurezza dell'Università Bío-Bío ha approvato questo progetto (borsa di studio Fondecyt 1200250). Il lavoro sugli animali è stato condotto in conformità con i principi cardine delle tre R nell'uso degli animali nella sperimentazione35 e secondo le raccomandazioni delle linee guida per la cur....
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Risultati
Questo protocollo valuta la capacità delle sEV derivate da placente coltivate in ipossia di interrompere la BBB in topi non gravidi. Questo metodo permette di comprendere meglio la potenziale connessione tra la placenta e il cervello in condizioni normali e patologiche. In particolare, questo metodo può costituire un proxy per analizzare la partecipazione delle sEV placentari all'insorgenza di complicanze cerebrali nella preeclampsia.
Contrariamente ai topi iniettati con sEVs-Nor, i topi iniet.......
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Discussione
Questo studio svela nuove intuizioni sul potenziale danno derivante dalle sEV isolate da espianti placentari coltivati in condizioni ipossiche sulla rottura della barriera emato-encefalica dei roditori. Il meccanismo patologico comporta una riduzione di CLND-5 nella regione cerebrale posteriore25.
Indagini precedenti hanno rivelato che le sEV plasmatiche di individui con preeclampsia inducono disfunzione endoteliale in vari organi utilizzando modelli in vitro <.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da dichiarare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare i ricercatori di GRIVAS Health per il loro prezioso contributo. Inoltre, le ostetriche e il personale clinico del Servizio di Ostetricia e Ginecologia appartengono all'Hospital de Chillan, in Cile. Fondata da Fondecyt Regular 1200250.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Topi adulti brain slecer matrice 3D stampato | File ad accesso aperto | Topi adulti | Affettatrice cerebrale per topi adulti. Stampato in filamento PLA. |
| Anticorpo primario anti β-actina | Sigma-Aldrich | Clon AC-74 | Anticorpo per il controllo del carico (Western blot) |
| Anticorpo primario anti-claudina5 | Santa cruz Biotechnology | sc-374221 | Anticorpo primario per la proteina a giunzione stretta CLDN5 dei topi BBB (Western blot) |
| Kit di proteine BCA | Thermo Scientific | 23225 | Kit per la misurazione della concentrazione proteica |
| Terreni di coltura #200 500 mL | Thermo Fisher Scientific | m200500 | Terreni di coltura per espianti placentari |
| D180 CO2 incubatore | RWD Life science | D180 | Incubatore standard per l'espianti e la coltura di sEVs-Nor |
| Evans colorante blu > 75% 10 g | Sigma-Aldrich | E2129.10G | Colorante per analizzare l'interruzione della barriera ematoencefalica IN VIVO |
| Siero fetale bovino 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Fattore di crescita additivo per terreni di coltura 200 |
| Himac Ultracentrifuga CP100NX | Himac eppendorf group | 5720410101 | Ultracentrifuga per terreni condizionati > 1,20.000 x g |
| Software | ImageJ NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Isoflurano x 100 mL | USP Baxter | 212-094 | Agente per anestesia volatile per inalazione per topi |
| Kit CellTiter 96 Non radioattivo | Promega | 0000105232 | In vitro test per la vitalità degli espianti placentari |
| Anticorpo secondario IgG di topo | Thermo Fisher Scientific | MO 63103 | Anticorpo secondario per CLDN5 (western blot) |
| NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | 90278090 | Analisi nanotracking di particelle da espianti placentari in terreni condizionati |
| Paraformaldehide E 97% soluzione 500 mL | Thermo Fisher Scientific | A11313.22 | Soluzione fissativa per fette di tessuto cerebrale e perfusione intracardica (una volta diluita) |
| PBS 1 X pH 7,4 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Soluzione di lavaggio per espianti di placenta |
| Penicilina-streptomicina 100x 20 mL | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | Antiobiotici per espianti placentari terreni |
| di colturaProOX C21 O2 e CO2 Controller per sottocamera | BioSpherix | SCR_021131 | Regolatore CO2 per indurre l'ipossia in camera stagna per sEVs-Hyp |
| Sodium Thiopental 1 g | Chemie | 7061 | per eutanasia umanitaria |
| Sistema di anestesia a basso flusso Somnosuite | Kent Scientifics | SS-01 | Vaporizzatore di isoflurano per piccoli roditori |
| Piattaforma di riscaldamento chirurgica | Kent Scientifics | A41166 | Piattaforma di riscaldamento per la manutenzione dell'anestesia nei topi |
| Filtri per siringhe, Politetrafluoroetilene (PTFE), idrofobico, 0,22 e micro; m, Sterile, 25 mm | Southern labware | 10026 | Filtrazione di terreni condizionati raccolti da espianti placentari |
| Microcentrifughe da tavolo ad alta velocità HITACHI himac CT15E/CT15RE | Sistemi medici Hitachi | 6020 | Centrifugazioni seriali di terreni condizionati < 1,20, 000 x g |
| Stereomicroscopio trinoculare a luce trasmidata e riflettente 10x-160x | Center Medical | 2597 | Stereomicroscopio per la registrazione di fette di cervello |
Riferimenti
- Lisonkova, S., Joseph, K. S. Incidence of preeclampsia: risk factors and outcomes associated with early- versus late-onset disease. Am J Obstet Gynecol. 209 (544), 544.e1-544.e12 (2013).
- Sibai, B., Dekker, G., Kupferminc, M. Preeclampsia. Lancet. 365 (9461), 785-799 (200....
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Ristampe e permessi
