Raccolta e coltura primaria di cellule endoteliali linfatiche leptomeningee

Sommario

Le cellule endoteliali linfatiche leptomeningee (LLEC), un tipo di cellula intracranica recentemente identificato, hanno funzioni poco conosciute. Questo studio presenta un protocollo riproducibile per la raccolta di LLEC dai topi e la creazione di colture primarie in vitro . Questo protocollo è progettato per consentire ai ricercatori di approfondire le funzioni cellulari e le potenziali implicazioni cliniche delle LLEC.

Abstract

Le cellule endoteliali linfatiche leptomeningee (LLEC) sono una popolazione cellulare intracranica scoperta di recente con una distribuzione unica chiaramente distinta dalle cellule endoteliali linfatiche periferiche. La loro funzione cellulare e le implicazioni cliniche rimangono in gran parte sconosciute. Di conseguenza, la disponibilità di una fornitura di LLEC è essenziale per condurre ricerche funzionali in vitro. Tuttavia, attualmente non esiste un protocollo esistente per la raccolta e la coltura di LLEC in vitro.

Questo studio ha raccolto con successo le LLEC utilizzando un protocollo a più fasi, che includeva il rivestimento del pallone con fibronectina, la dissezione delle leptomeningi con l'assistenza di un microscopio, la digestione enzimatica delle leptomeningi per preparare una sospensione a singola cellula, l'induzione dell'espansione delle LLEC con il fattore di crescita dell'endotelio vascolare-C (VEGF-C) e la selezione di cellule positive al recettore ialuronico dei vasi linfatici-1 (LYVE-1) attraverso la selezione cellulare attivata magneticamente (MACS). Questo processo ha portato alla creazione di una cultura primaria. La purezza degli LLEC è stata confermata attraverso la colorazione in immunofluorescenza e l'analisi citofluorimetrica, con un livello di purezza superiore al 95%. Questo protocollo in più fasi ha dimostrato riproducibilità e fattibilità, il che faciliterà notevolmente l'esplorazione della funzione cellulare e delle implicazioni cliniche delle LLEC.

Introduzione

Le cellule endoteliali linfatiche leptomeningee (LLEC) appena scoperte formano un reticolo di singole cellule all'interno delle leptomeningi, mostrando un modello di distribuzione distinto rispetto alle cellule endoteliali linfatiche periferiche ^1,2. Le funzioni cellulari e le implicazioni cliniche associate alle LLEC rimangono in gran parte un territorio inesplorato. Al fine di aprire la strada alla ricerca funzionale sui LLEC, è imperativo stabilire un modello in vitro per il loro studio. Pertanto, questo studio ha ideato un protocollo completo per l'isolamento e la coltura pri....

Protocollo

Questa ricerca ha ricevuto l'approvazione del Comitato Etico per gli Esperimenti Animali dell'Università di Medicina di Kunming (kmmu20220945). Tutti gli esperimenti hanno aderito alle linee guida stabilite per la cura degli animali. Le cellule endoteliali linfatiche leptomeningee (LLEC) sono state raccolte da topi maschi C57Bl/6J di età compresa tra 6 e 8 settimane e di peso compreso tra 20 e 25 g. Questi topi sono stati acquistati dalla Kunming Medical University di Kunming, in Cina. L'intera procedura sperimentale è stata condotta in condizioni di sterilità rigorosa. Tutte le fasi di centrifugazione vengono eseguite a temperatura ambiente se non diversamente specif....

Risultati

Questo studio presenta un protocollo riproducibile in più fasi per la raccolta di cellule endoteliali linfatiche (LLEC) dai topi e successivamente la creazione della loro coltura primaria in vitro. Le fasi chiave riguardano la preparazione del matraccio e il rivestimento della fibronectina, la dissociazione delle leptomeningi, l'ottenimento di una sospensione unicellulare attraverso la digestione enzimatica e l'induzione dell'espansione delle LLEC con VEGF-C. Le LLEC LYVE-1-positive vengono quindi isolate selett.......

Discussione

Il protocollo esistente per la raccolta e la coltura di LLEC in vitro non è stato precedentemente riportato. Questo studio introduce un protocollo riproducibile e multiprocedurale per la raccolta e la coltura di LLEC da leptomeningi di topo.

Sebbene questo protocollo multiprocedurale sia riproducibile, ci sono diverse considerazioni chiave. Ad esempio, i palloni T25 rivestiti di fibronectina promuovono l'adesione delle LLEC e funzionano eliminando le cellule non aderenti, garantendo c.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Blocca buffer	Beyotime	P0102	Memorizza aliquote su – 4 gradi C
Collagenase I	Solarbio	C8140	Conservare le aliquote a 20 ° C
DAPI	Beyotime	P0131	Memorizza aliquote a – 20 ° C
DMEM	Solarbio	11995	Memorizza le aliquote a – 4 gradi C
D-PBS	Solarbio	D1041	Conservare le aliquote a – 4 gradi C
EGM-2 MV Bullet Kit	Lonza	C-3202	Negozio aliquote a – 4 gradi C
FBS	Solarbio	S9010	Memorizza le aliquote su – 20 ° C
Fibronectina	Solarbio	F8180	Memorizza le aliquote su – 20 ° C
FlowJo Software	BD Biosciences	V10.8.1
LYVE-1 anticorpo	eBioscience	12-0443-82	Memorizza aliquote su – 4 gradi C
Separatore magnetico	Miltenyi	130-042-302	Sterile prima dell'uso
Supporto separatore magnetico	Miltenyi	130-042-303	Sterile prima dell'uso
Microsfere	Miltenyi	130-048-801	Conservare le aliquote a – 4 gradi C
P/S	Solarbio	P1400	Conservare le aliquote a – 20 ° C
Papain	Solarbio	G8430-25g	Negozio aliquote a – 20 ° C
PBS	Solarbio	D1040	Memorizza le aliquote su – 4 gradi C
PDPN anticorpo	Santa	sc-53533	Conservare le aliquote su – 4 gradi C
PFA	Solarbio	P1110	Memorizza le aliquote su – 4 gradi
C PROX1 anticorpo	Santa	sc-81983	Conservare le aliquote su – 4 gradi C
Colonna di selezione	Miltenyi	130-042-401	Sterile prima dell'uso
Trypsin	Gibco	25200072	Conservare le aliquote a – 20 ° C
VEGF-C	Abcam	ab51947	Memorizza aliquote su – 20 ° C
VEGFR-3 anticorpo	Santa	sc-514825	Conservare le aliquote a – 4 gradi E