Colheita e Cultura Primária de Células Endoteliais Linfáticas Leptomeníngeas

Summary

As células endoteliais linfáticas leptomeníngeas (LLECs), um tipo de célula intracraniana recentemente identificado, têm funções pouco compreendidas. Este estudo apresenta um protocolo reprodutível para a colheita de LLECs de camundongos e estabelecimento de culturas primárias in vitro . Este protocolo é projetado para permitir que os pesquisadores se aprofundem nas funções celulares e potenciais implicações clínicas de LLECs.

Abstract

As células endoteliais linfáticas leptomeníngeas (LLECs) são uma população celular intracraniana recentemente descoberta com uma distribuição única claramente distinta das células endoteliais linfáticas periféricas. Sua função celular e implicações clínicas permanecem em grande parte desconhecidas. Consequentemente, a disponibilidade de um suprimento de LLECs é essencial para a realização de pesquisas funcionais in vitro. No entanto, atualmente não existe um protocolo para colheita e cultivo de LLECs in vitro.

Este estudo colheu LLECs com sucesso usando um protocolo de várias etapas, que incluiu o revestimento do frasco com fibronectina, dissecando as leptomeninges com o auxílio de um microscópio, digerindo enzimaticamente as leptomeninges para preparar uma suspensão de célula única, induzindo a expansão de LLECs com fator de crescimento endotelial vascular-C (VEGF-C) e selecionando células positivas para receptor hialurônico de vasos linfáticos-1 (LYVE-1) através de triagem celular ativada por magnetismo (MACS). Esse processo acabou levando ao estabelecimento de uma cultura primária. A pureza dos LLECs foi confirmada através da coloração por imunofluorescência e análise por citometria de fluxo, com um nível de pureza superior a 95%. Este protocolo de várias etapas demonstrou reprodutibilidade e viabilidade, o que facilitará sobremaneira a exploração da função celular e as implicações clínicas dos LLECs.

Introduction

As recém-descobertas células endoteliais linfáticas leptomeníngeas (LLECs) formam uma malha de células individuais dentro das leptomeninges, exibindo um padrão de distribuição distinto quando comparadas às células endoteliais linfáticas periféricas ^1,2. As funções celulares e as implicações clínicas associadas aos LLECs permanecem em grande parte território desconhecido. A fim de abrir caminho para a pesquisa funcional em LLECs, é imperativo estabelecer um modelo in vitro para o seu estudo. Portanto, este estudo elaborou um protocolo abrangente para o isolamento e cultura primária de LLECs.

Camundongos são o modelo animal preferido devido à sua adequação para manipulação genética em pesquisas de doenças. Estudos prévios isolaram com sucesso células endoteliais linfáticas de vários tecidos de camundongos, incluindo linfonodos³, tecido mesentérico⁴, tecido dérmico⁵, linfáticos coletores⁶ e tecido pulmonar⁷. Esses procedimentos de isolamento têm se baseado principalmente em técnicas como a classificação de células ativadas por magnetismo (MACS) e a classificação por citometria de fluxo ^8,9,10. Além disso, esforços de pesquisa levaram ao estabelecimento de linhagens de células aracnoides de ratos e linhagens de células capilares linfáticas de^ratos11,12. Apesar da existência de técnicas de cultura de explantes para leptomeninges¹³, existe uma necessidade urgente de um protocolo padronizado para o isolamento e cultivo de LLECs. Consequentemente, este estudo colheu e cultivou com sucesso LLECs dissociando meticulosamente leptomeninges sob a orientação de um microscópio e promovendo a expansão de LLECs através do uso do fator de crescimento endotelial vascular-C (VEGF-C). O marcador distintivo das células endoteliais linfáticas é o receptor hialurônico dos vasos linfáticos-1 (LYVE-1)¹⁴. Este protocolo de várias etapas isola seletivamente LLECs LYVE-1-positivos usando MACS e, posteriormente, verifica sua pureza através de análise por citometria de fluxo e coloração por imunofluorescência.

As etapas primárias deste protocolo de várias etapas podem ser resumidas da seguinte forma: revestimento do frasco, dissociação de leptomeninges, digestão enzimática de leptomeninges, expansão celular, seleção de células magnéticas e subsequente cultura de LLECs. Finalmente, a pureza dos LLECs isolados é confirmada através de análise por citometria de fluxo e coloração por imunofluorescência. O objetivo geral deste estudo é apresentar um protocolo reprodutível em várias etapas para o isolamento de LLECs de leptomeninges de camundongos e seu subsequente cultivo in vitro . Este protocolo está pronto para facilitar muito as investigações sobre as funções celulares e implicações clínicas dos LLECs.

Protocol

Esta pesquisa recebeu aprovação do Comitê de Ética em Experimentação Animal da Kunming Medical University (kmmu20220945). Todos os experimentos seguiram as diretrizes estabelecidas para os cuidados com os animais. Células endoteliais linfáticas leptomeníngeas (LLECs) foram coletadas de camundongos machos C57Bl/6J com idade entre 6-8 semanas e peso entre 20-25 g. Esses camundongos foram adquiridos da Universidade de Medicina de Kunming, em Kunming, na China. Todo o procedimento experimental foi conduzido sob rigo…

Representative Results

Este estudo apresenta um protocolo reprodutível de várias etapas para a coleta de células endoteliais linfáticas (LLECs) de camundongos e, posteriormente, estabelecimento de sua cultura primária in vitro. As principais etapas envolvem a preparação do frasco e o revestimento da fibronectina, a dissociação das leptomeninges, a obtenção de uma suspensão unicelular por digestão enzimática e a indução da expansão dos LLECs com VEGF-C. LLECs LYVE-1-positivos são então seletivamente isolados usando c…

Discussion

O protocolo existente para colheita e cultivo de LLECs in vitro não foi relatado anteriormente. Este estudo apresenta um protocolo multiprocedimento reprodutível para coleta e cultivo de LLECs de leptomeninges de camundongos.

Embora esse protocolo multiprocedimento seja reprodutível, há várias considerações importantes. Por exemplo, frascos T25 revestidos com fibronectina promovem a adesão de LLECs e funcionam eliminando células não aderentes, garantindo assim uma populaçã…

Materials

Block buffer	Beyotime	P0102	Store aliquots at –4 °C
Collagenase I	Solarbio	C8140	Store aliquots at –20 °C
DAPI	Beyotime	P0131	Store aliquots at –20 °C
DMEM	Solarbio	11995	Store aliquots at –4 °C
D-PBS	Solarbio	D1041	Store aliquots at –4 °C
EGM-2 MV Bullet Kit	Lonza	C-3202	Store aliquots at –4 °C
FBS	Solarbio	S9010	Store aliquots at –20 °C
Fibronectin	Solarbio	F8180	Store aliquots at –20 °C
FlowJo Software	BD Biosciences	V10.8.1
LYVE-1 antibody	eBioscience	12-0443-82	Store aliquots at –4 °C
Magnetic separator	Miltenyi	130-042-302	Sterile before use
Magnetic separator stand	Miltenyi	130-042-303	Sterile before use
Microbeads	Miltenyi	130-048-801	Store aliquots at –4 °C
P/S	Solarbio	P1400	Store aliquots at –20 °C
Papain	Solarbio	G8430-25g	Store aliquots at –20 °C
PBS	Solarbio	D1040	Store aliquots at –4 °C
PDPN antibody	Santa	sc-53533	Store aliquots at –4 °C
PFA	Solarbio	P1110	Store aliquots at –4 °C
PROX1 antibody	Santa	sc-81983	Store aliquots at –4 °C
Selection column	Miltenyi	130-042-401	Sterile before use
Trypsin	Gibco	25200072	Store aliquots at –20 °C
VEGF-C	Abcam	ab51947	Store aliquots at –20 °C
VEGFR-3 antibody	Santa	sc-514825	Store aliquots at –4 °C