लेप्टोमेनिंगियल लसीका एंडोथेलियल कोशिकाओं की फसल और प्राथमिक संस्कृति
Summary
लेप्टोमेनिंगियल लसीका एंडोथेलियल कोशिकाएं (एलएलईसी), हाल ही में पहचाने गए इंट्राक्रैनील सेल प्रकार, खराब समझ वाले कार्यों को समझते हैं। यह अध्ययन चूहों से एलएलईसी की कटाई और इन विट्रो प्राथमिक संस्कृतियों में स्थापित करने के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। यह प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को सेलुलर कार्यों और एलएलईसी के संभावित नैदानिक प्रभावों में तल्लीन करने में सक्षम बनाने के लिए डिज़ाइन किया गया है।
Abstract
लेप्टोमेनिंगियल लसीका एंडोथेलियल कोशिकाएं (एलएलईसी) हाल ही में खोजी गई इंट्राक्रैनील सेलुलर आबादी हैं जिनका एक अनूठा वितरण परिधीय लसीका एंडोथेलियल कोशिकाओं से स्पष्ट रूप से अलग है। उनके सेलुलर फ़ंक्शन और नैदानिक निहितार्थ काफी हद तक अज्ञात रहते हैं। नतीजतन, इन विट्रो में कार्यात्मक अनुसंधान करने के लिए एलएलईसी की आपूर्ति की उपलब्धता आवश्यक है। हालांकि, इन विट्रो में एलएलईसी की कटाई और संवर्धन के लिए वर्तमान में कोई मौजूदा प्रोटोकॉल नहीं है।
इस अध्ययन ने सफलतापूर्वक एक बहु-चरण प्रोटोकॉल का उपयोग करके एलएलईसी काटा, जिसमें फाइब्रोनेक्टिन के साथ फ्लास्क को कोटिंग करना, माइक्रोस्कोप की सहायता से लेप्टोमेनिंग को विच्छेदित करना, एकल-कोशिका निलंबन तैयार करने के लिए लेप्टोमेनिंग को एंजाइमेटिक रूप से पचाना, संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर-सी (वीईजीएफ-सी) के साथ एलएलईसी के विस्तार को प्रेरित करना, और चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एमएसीएस) के माध्यम से लसीका पोत हाइलूरोनिक रिसेप्टर -1 (एलवाईवीई -1) सकारात्मक कोशिकाओं का चयन करना। इस प्रक्रिया ने अंततः एक प्राथमिक संस्कृति की स्थापना की। एलएलईसी की शुद्धता की पुष्टि इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला और प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के माध्यम से की गई थी, जिसमें शुद्धता का स्तर 95% से अधिक था। इस बहु-चरण प्रोटोकॉल ने प्रजनन क्षमता और व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया है, जो सेलुलर फ़ंक्शन और एलएलईसी के नैदानिक निहितार्थों की खोज को बहुत सुविधाजनक बनाएगा।
Introduction
नव खोजा लेप्टोमेनिंगियल लसीका एंडोथेलियल कोशिकाओं (एलएलईसी) लेप्टोमेनिंग के भीतर व्यक्तिगत कोशिकाओं का एक जाल बनाते हैं, परिधीय लसीका एंडोथेलियल कोशिकाओं 1,2की तुलना में एक अलग वितरण पैटर्न प्रदर्शित करते हैं। एलएलईसी से जुड़े सेलुलर कार्य और नैदानिक निहितार्थ काफी हद तक अज्ञात क्षेत्र बने हुए हैं। एलएलईसी पर कार्यात्मक अनुसंधान का मार्ग प्रशस्त करने के लिए, उनके अध्ययन के लिए इन विट्रो मॉडल स्थापित करना अनिवार्य है। इसलिए, इस अध्ययन ने एलएलईसी के अलगाव और प्राथमिक संस्कृति के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल तैयार किया है।
रोग अनुसंधान में आनुवंशिक हेरफेर के लिए उनकी उपयुक्तता के कारण चूहे पसंदीदा पशु मॉडल हैं। पिछले अध्ययनों ने लिम्फ नोड्स3, मेसेंटेरिक ऊतक4, त्वचीय ऊतक5, लिम्फेटिक्स6 और फेफड़े के ऊतक7 एकत्र करने सहित विभिन्न माउस ऊतकों से लसीका एंडोथेलियल कोशिकाओं को सफलतापूर्वक अलग किया है। इन अलगाव प्रक्रियाओं ने मुख्य रूप से चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एमएसीएस) और प्रवाह साइटोमेट्री सॉर्टिंग 8,9,10 जैसी तकनीकों पर भरोसा किया है। इसके अतिरिक्त, अनुसंधान के प्रयासों चूहा arachnoid सेल लाइनों और चूहा लसीका केशिका सेल लाइनों11,12 की स्थापना के लिए नेतृत्व किया है. लेप्टोमेनिंग13 के लिए एक्सप्लांट कल्चर तकनीकों के अस्तित्व के बावजूद, एलएलईसी के अलगाव और संस्कृति के लिए एक मानकीकृत प्रोटोकॉल की तत्काल आवश्यकता मौजूद है। नतीजतन, इस अध्ययन ने माइक्रोस्कोप के मार्गदर्शन में लेप्टोमेनिंग को सावधानीपूर्वक अलग करके और संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर-सी (वीईजीएफ-सी) के उपयोग के माध्यम से एलएलईसी विस्तार को बढ़ावा देकर एलएलईसी को सफलतापूर्वक काटा और सुसंस्कृत किया है। लसीका एंडोथेलियल कोशिकाओं के लिए विशिष्ट मार्कर लसीका पोत हयालूरोनिक रिसेप्टर -1 (एलवाईवीई -1)14है। यह बहु-चरण प्रोटोकॉल एमएसीएस का उपयोग करके चुनिंदा रूप से एलवाईवी-1-पॉजिटिव एलएलईसी को अलग करता है और बाद में प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण और इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला के माध्यम से उनकी शुद्धता की पुष्टि करता है।
इस बहु-चरण प्रोटोकॉल के प्राथमिक चरणों को निम्नानुसार संक्षेप में प्रस्तुत किया जा सकता है: फ्लास्क कोटिंग, लेप्टोमेनिंग का पृथक्करण, लेप्टोमेनिंग का एंजाइमेटिक पाचन, सेल विस्तार, चुंबकीय सेल चयन, और एलएलईसी की बाद की संस्कृति। अंत में, पृथक एलएलईसी की शुद्धता की पुष्टि प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण और इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला के माध्यम से की जाती है। इस अध्ययन के व्यापक उद्देश्य माउस leptomeninges और इन विट्रो संस्कृति में उनके बाद LLECs के अलगाव के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, बहु कदम प्रोटोकॉल पेश करने के लिए है. यह प्रोटोकॉल सेलुलर कार्यों और एलएलईसी के नैदानिक निहितार्थों में जांच को सुविधाजनक बनाने के लिए तैयार है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इन विट्रो में एलएलईसी की कटाई और संवर्धन के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल पहले रिपोर्ट नहीं किया गया है। यह अध्ययन माउस लेप्टोमेनिंग से एलएलईसी की कटाई और संवर्धन के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, ब?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
अध्ययन को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81960226, 81760223), युन्नान प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (202001AS070045, 202301AY070001-011), और युन्नान प्रांत शिक्षा विभाग के वैज्ञानिक अनुसंधान फाउंडेशन (2023Y0784) के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Block buffer | Beyotime | P0102 | Store aliquots at –4 °C |
| Collagenase I | Solarbio | C8140 | Store aliquots at –20 °C |
| DAPI | Beyotime | P0131 | Store aliquots at –20 °C |
| DMEM | Solarbio | 11995 | Store aliquots at –4 °C |
| D-PBS | Solarbio | D1041 | Store aliquots at –4 °C |
| EGM-2 MV Bullet Kit | Lonza | C-3202 | Store aliquots at –4 °C |
| FBS | Solarbio | S9010 | Store aliquots at –20 °C |
| Fibronectin | Solarbio | F8180 | Store aliquots at –20 °C |
| FlowJo Software | BD Biosciences | V10.8.1 | |
| LYVE-1 antibody | eBioscience | 12-0443-82 | Store aliquots at –4 °C |
| Magnetic separator | Miltenyi | 130-042-302 | Sterile before use |
| Magnetic separator stand | Miltenyi | 130-042-303 | Sterile before use |
| Microbeads | Miltenyi | 130-048-801 | Store aliquots at –4 °C |
| P/S | Solarbio | P1400 | Store aliquots at –20 °C |
| Papain | Solarbio | G8430-25g | Store aliquots at –20 °C |
| PBS | Solarbio | D1040 | Store aliquots at –4 °C |
| PDPN antibody | Santa | sc-53533 | Store aliquots at –4 °C |
| PFA | Solarbio | P1110 | Store aliquots at –4 °C |
| PROX1 antibody | Santa | sc-81983 | Store aliquots at –4 °C |
| Selection column | Miltenyi | 130-042-401 | Sterile before use |
| Trypsin | Gibco | 25200072 | Store aliquots at –20 °C |
| VEGF-C | Abcam | ab51947 | Store aliquots at –20 °C |
| VEGFR-3 antibody | Santa | sc-514825 | Store aliquots at –4 °C |
Riferimenti
- Shibata-Germanos, S., et al. Structural and functional conservation of non-lumenized lymphatic endothelial cells in the mammalian leptomeninges. Acta Neuropathologica. 139 (2), 383-401 (2020).
- Suárez, I., Schulte-Merker, S. Cells with many talents: lymphatic endothelial cells in the brain meninges. Cells. 10 (4), 799 (2021).
- Jordan-Williams, K. L., Ruddell, A. Culturing purifies murine lymph node lymphatic endothelium. Lymphatic Research and Biology. 12 (3), 144-149 (2014).
- Jones, B. E., Yong, L. C. Culture and characterization of bovine mesenteric lymphatic endothelium. In vitro Cellular & Developmental Biology. 23 (10), 698-706 (1987).
- Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
- Jablon, K. L., et al. Isolation and short-term culturing of primary lymphatic endothelial cells from collecting lymphatics: A techniques study. Microcirculation. 30 (2-3), e12778 (2023).
- Lapinski, P. E., King, P. D. Isolation and culture of mouse lymphatic endothelial cells from lung tissue. Methods in Molecular Biology. 2319, 69-75 (2021).
- Lokmic, Z. Isolation, Identification, and culture of human lymphatic endothelial cells. Methods in Molecular Biology. 1430, 77-90 (2016).
- Thiele, W., Rothley, M., Schmaus, A., Plaumann, D., Sleeman, J. Flow cytometry-based isolation of dermal lymphatic endothelial cells from newborn rats. Lymphology. 47 (4), 177-186 (2014).
- Lokmic, Z., et al. Isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting. Journal of Visualized Experiments. 99, e52691 (2015).
- Janson, C., Romanova, L., Hansen, E., Hubel, A., Lam, C. Immortalization and functional characterization of rat arachnoid cell lines. Neuroscienze. 177, 23-34 (2011).
- Romanova, L. G., Hansen, E. A., Lam, C. H. Generation and preliminary characterization of immortalized cell line derived from rat lymphatic capillaries. Microcirculation. 21 (6), 551-561 (2014).
- Park, T. I., et al. Routine culture and study of adult human brain cells from neurosurgical specimens. Nature Protocols. 17 (2), 190-221 (2022).
- Okuda, K. S., et al. lyve1 expression reveals novel lymphatic vessels and new mechanisms for lymphatic vessel development in zebrafish. Development. 139 (13), 2381-2391 (2012).
- Bokobza, C., et al. Magnetic Isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures. Journal of Visualized Experiments. 185, e62964 (2022).
- Wang, J. M., Chen, A. F., Zhang, K. Isolation and primary culture of mouse aortic endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. 118, e52965 (2016).
- Breiteneder-Geleff, S., et al. Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. The American Journal of Pathology. 154 (2), 385-394 (1999).
- Petrova, T. V., Koh, G. Y. Organ-specific lymphatic vasculature: From development to pathophysiology. The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 35-49 (2018).
- Wilting, J., et al. The transcription factor Prox1 is a marker for lymphatic endothelial cells in normal and diseased human tissues. The FASEB Journal. 16 (10), 1271-1273 (2002).
- Yin, X., et al. Lymphatic endothelial heparan sulfate deficiency results in altered growth responses to vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C). The Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 14952-14962 (2011).
- DeSisto, J., et al. Single-cell transcriptomic analyses of the developing meninges reveal meningeal fibroblast diversity and function. Developmental Cell. 54 (1), 43-59 (2020).
- Chen, Z., et al. A method for eliminating fibroblast contamination in mouse and human primary corneal epithelial cell cultures. Current Eye Research. , 1-11 (2023).
- Starzonek, C., et al. Enrichment of human dermal stem cells from primary cell cultures through the elimination of fibroblasts. Cells. 12 (6), 949 (2023).
- Lam, C. H., Romanova, L., Hubel, A., Janson, C., Hansen, E. A. The influence of fibroblast on the arachnoid leptomeningeal cells in vitro. Brain Research. 1657, 109-119 (2017).
