軟髄膜リンパ管内皮細胞の採取と初代培養

Summary

最近同定された頭蓋内細胞タイプである軟髄膜リンパ内皮細胞(LREC)は、機能が十分に理解されていません。この研究は、マウスからLLECを採取し、 in vitro 初代培養を確立するための再現性のあるプロトコルを提示します。このプロトコルは、研究者がLLECの細胞機能と潜在的な臨床的意味を掘り下げることができるように設計されています。

Abstract

軟髄膜リンパ内皮細胞(LREC)は、末梢リンパ内皮細胞とは明らかに異なる独特の分布を持つ、最近発見された頭蓋内細胞集団です。それらの細胞機能と臨床的意味は、ほとんど不明のままです。したがって、LLECの供給は、in vitroで機能研究を行うために不可欠です。しかし、現在、in vitroでLLECを収穫および培養するための既存のプロトコルはありません。

この研究では、フラスコをフィブロネクチンでコーティングし、顕微鏡の助けを借りて軟髄膜を解剖し、軟髄膜を酵素的に消化して単一細胞懸濁液を調製し、血管内皮増殖因子-C(VEGF-C)でLLECの増殖を誘導し、磁気活性化細胞選別(MACS)によるリンパ管ヒアルロン酸受容体-1(LYVE-1)陽性細胞を選択するなど、多段階のプロトコルを使用してLLECを採取することに成功しました。このプロセスは、最終的に一次文化の確立につながりました。LLECの純度は、免疫蛍光染色およびフローサイトメトリー解析によって確認され、純度レベルは95%を超えました。この多段階プロトコルは、再現性と実現可能性を実証しており、LLECの細胞機能と臨床的意味の探求を大幅に促進します。

Introduction

新たに発見された軟髄膜リンパ管内皮細胞(LLEC)は、軟髄膜内の個々の細胞の網目構造を形成し、末梢リンパ管内皮細胞と比較して明確な分布パターンを示します^1,2。LLECに関連する細胞機能と臨床的意味合いは、ほとんど未知の領域のままです。LLECの機能研究への道を開くためには、その研究のためのin vitroモデルを確立することが不可欠です。したがって、この研究では、LLECの単離と初代培養のための包括的なプロトコルを考案しました。

マウスは、疾患研究における遺伝子操作に適しているため、好ましい動物モデルです。これまでの研究では、リンパ節³、腸間膜組織⁴、真皮組織⁵、採取リンパ管⁶、肺組織⁷など、さまざまなマウス組織からリンパ内皮細胞を単離することに成功しています。これらの単離手順は、主に磁気活性化細胞選別(MACS)やフローサイトメトリーソーティングなどの技術に依存してきました^8,9,10。さらに、研究努力により、ラットくも膜細胞株およびラットリンパ毛細血管細胞株が確立されました^11,12。軟髄膜¹³の外植片培養技術が存在するにもかかわらず、LLECの単離と培養のための標準化されたプロトコルが緊急に必要とされています。その結果、本研究では、顕微鏡のガイド下で細髄膜を細心の注意を払って解離させ、血管内皮増殖因子-C(VEGF-C)を用いてLLECの増殖を促進することで、LLECの採取と培養に成功しました。リンパ管内皮細胞の特徴的なマーカーは、リンパ管ヒアルロン酸受容体-1(LYVE-1)¹⁴である。このマルチステッププロトコルでは、MACSを用いてLYVE-1陽性LLECを選択的に単離し、その後、フローサイトメトリー解析と免疫蛍光染色によってその純度を検証します。

この多段階のプロトコルの主なステップは次の通り要約することができる:フラスコのコーティング、leptomeningesの解離、leptomeningesの酵素の消化力、細胞拡張、磁気細胞の選択およびそれに続くLLECsの培養。最後に、単離されたLLECの純度は、フローサイトメトリー分析および免疫蛍光染色によって確認されます。この研究の包括的な目的は、マウス軟髄膜およびその後の in vitro 培養からLLECを単離するための再現性のある多段階プロトコルを提示することです。このプロトコルはLLECsの細胞機能そして臨床含意に調査を非常に促進するために態勢を整える。

Protocol

本研究成果は、昆明医科大学動物実験倫理委員会(kmmu20220945)の承認を得ました。すべての実験は、確立された動物管理ガイドラインに従っていました。軟髄膜リンパ管内皮細胞(LREC)は、6〜8週齢、体重20〜25gの雄のC57Bl/6Jマウスから採取した。これらのマウスは、中国の昆明にある昆明医科大学から調達しました。実験手順全体は、厳格な無菌条件下で実施されました。遠心分離工程は、特に?…

Representative Results

この研究は、マウスからリンパ管内皮細胞(LLECs)を採取し、その後in vitroで初代培養を確立するための再現性のある多段階プロトコルを提示します。重要なステップには、フラスコの調製とフィブロネクチンコーティング、軟髄膜の解離、酵素消化による単一細胞懸濁液の取得、およびVEGF-CによるLLECの増殖の誘導が含まれます。次に、LYVE-1陽性LLECは、磁気活性化セルソーティング(MACS)?…

Discussion

in vitroでLLECを採取および培養するための既存のプロトコルは、以前に報告されていません。この研究では、マウス軟髄膜からLLECを採取および培養するための再現性のあるマルチプロシージャルプロトコルを紹介します。

このマルチプロシージャルプロトコルは再現可能ですが、いくつかの重要な考慮事項があります。例えば、フィブロネクチンでコーティングさ?…

Materials

Block buffer	Beyotime	P0102	Store aliquots at –4 °C
Collagenase I	Solarbio	C8140	Store aliquots at –20 °C
DAPI	Beyotime	P0131	Store aliquots at –20 °C
DMEM	Solarbio	11995	Store aliquots at –4 °C
D-PBS	Solarbio	D1041	Store aliquots at –4 °C
EGM-2 MV Bullet Kit	Lonza	C-3202	Store aliquots at –4 °C
FBS	Solarbio	S9010	Store aliquots at –20 °C
Fibronectin	Solarbio	F8180	Store aliquots at –20 °C
FlowJo Software	BD Biosciences	V10.8.1
LYVE-1 antibody	eBioscience	12-0443-82	Store aliquots at –4 °C
Magnetic separator	Miltenyi	130-042-302	Sterile before use
Magnetic separator stand	Miltenyi	130-042-303	Sterile before use
Microbeads	Miltenyi	130-048-801	Store aliquots at –4 °C
P/S	Solarbio	P1400	Store aliquots at –20 °C
Papain	Solarbio	G8430-25g	Store aliquots at –20 °C
PBS	Solarbio	D1040	Store aliquots at –4 °C
PDPN antibody	Santa	sc-53533	Store aliquots at –4 °C
PFA	Solarbio	P1110	Store aliquots at –4 °C
PROX1 antibody	Santa	sc-81983	Store aliquots at –4 °C
Selection column	Miltenyi	130-042-401	Sterile before use
Trypsin	Gibco	25200072	Store aliquots at –20 °C
VEGF-C	Abcam	ab51947	Store aliquots at –20 °C
VEGFR-3 antibody	Santa	sc-514825	Store aliquots at –4 °C