Imaging vitale og ikke-vitale hjernepericytter i hjerneskiver efter subaraknoid blødning
Summary
Den foreløbige undersøgelse bekræfter, at subaraknoid blødning (SAH) forårsager hjernepericytdød. Evaluering af pericytkontraktilitet efter SAH kræver differentiering mellem levedygtige og ikke-levedygtige hjernepericytter. Derfor er der udviklet en procedure til at mærke levedygtige og ikke-levedygtige hjernepericytter samtidigt i hjernesektioner, hvilket letter observation ved hjælp af et konfokalmikroskop med høj opløsning.
Abstract
Pericytter er afgørende vægmalerier beliggende i cerebral mikrocirkulation, afgørende for aktivt modulerende cerebral blodgennemstrømning via kontraktilitetsjusteringer. Konventionelt måles deres kontraktilitet ved at observere morfologiske skift og nærliggende kapillærdiameterændringer under specifikke omstændigheder. Alligevel bliver postvævsfiksering, evaluering af vitalitet og efterfølgende pericytkontraktilitet af afbildede hjernepericytter kompromitteret. På samme måde er genetisk mærkning af hjernepericytter kort i at skelne mellem levedygtige og ikke-levedygtige pericytter, især i neurologiske tilstande som subaraknoid blødning (SAH), hvor vores foreløbige undersøgelse validerer hjernens pericytdød. En pålidelig protokol er blevet udtænkt for at overvinde disse begrænsninger, hvilket muliggør samtidig fluorescerende mærkning af både funktionelle og ikke-funktionelle hjernepericytter i hjernesektioner. Denne mærkningsmetode tillader højopløsnings konfokal mikroskopvisualisering, samtidig med at hjerneskivens mikrovaskulatur markeres. Denne innovative protokol giver et middel til at vurdere hjernens pericytkontraktilitet, dens indvirkning på kapillærdiameter og pericytstruktur. Undersøgelse af hjernens pericytkontraktilitet inden for SAH-konteksten giver indsigtsfuld forståelse af dens virkninger på cerebral mikrocirkulation.
Introduction
Hjernepericytter, kendetegnet ved deres slanke fremspring og fremspringende cellelegemer, omkranser mikrocirkulationen 1,2. Mens cerebral blodgennemstrømningsforøgelse overvejende drives af kapillær udvidelse, udviser mindre arterier langsommere dilatationshastigheder3. Pericytkontraktilitet udøver indflydelse på kapillærdiameter og pericytmorfologi, hvilket påvirker vaskulær dynamik4. Sammentrækning af hjernepericytter fører til kapillær indsnævring, og i patologiske scenarier kan overdreven sammentrækning hæmme erytrocytstrømmen5. Forskellige faktorer, herunder noradrenalin frigivet fra locus coeruleus, kan fremkalde hjernepericytkontraktion inden for kapillærer6. Med en regulerende rolle i cerebral blodgennemstrømning udviser pericytter 20-HETE-syntese, der tjener som en iltføler under hyperoxia7. Oxidativ-nitrativ stress-udløst sammentrækning af hjernens pericytter påvirker kapillærerne negativt5. På trods af både in vivo- og ex vivo-undersøgelser af hjernens pericytkontraktion 8 er der fortsat begrænset viden om billeddannelse af levedygtige og ikke-levedygtige hjernepericytter i hjerneskiver.
Det er afgørende, at billeddannelse efter vævsfiksering af hjernens pericytter kompromitterer deres vitalitet og efterfølgende kontraktilitetsvurdering. Desuden kan transgen mærkning af hjernepericytter i scenarier som neurologiske lidelser (f.eks. Subaraknoid blødning – SAH) ikke skelne mellem levedygtige og ikke-levedygtige pericyter, som bekræftet af vores foreløbige SAH-inducerede hjernepericytdødsundersøgelse9.
For at overvinde disse udfordringer anvendte vi TO-PRO-3 til at mærke levende pericytter, mens afdøde blev farvet med propidiumiodid (PI). Vi brugte konfokale billeddannelsesteknologier med høj opløsning til at visualisere levedygtige og ikke-levedygtige hjernepericytter i hjerneskiver, samtidig med at skiveaktiviteten bevares under billeddannelsen. Denne artikel har til formål at præsentere en reproducerbar metode til billeddannelse af levedygtige og ikke-levedygtige hjernepericytter i hjerneskiver, der tjener som et værdifuldt værktøj til at undersøge virkningen af hjernepericytter på cerebral mikrocirkulation efter SAH.
Protocol
Representative Results
Discussion
Udviklet er højopløselige konfokale billeddannelsesteknikker til visualisering af vitale hjernepericytter, ikke-vitale hjernepericytter og mikrovaskulaturen i hjerneskiver. I akutte rottehjerneskiver indebærer processen indledende mærkning af pericytter med TO-PRO-311 efterfulgt af mikrovaskulære endotelceller med IB412; efterfølgende udføres identifikation af afdøde pericytter ved hjælp af PI. Denne protokol er ligetil, reproducerbar og yderst anvendelig til funkt…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Undersøgelsen blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (81960226,81760223); Naturvidenskabsfonden i Yunnan-provinsen (202001AS070045,202301AY070001-011)
Materials
| 6-well plate | ABC biochemistry | ABC703006 | RT |
| Adobe Photoshop | Adobe | Adobe Illustrator CS6 16.0.0 | RT |
| Aluminium foil | MIAOJIE | 225 mm x 273 mm | RT |
| CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | RT |
| Confocal imaging software | Nikon | NIS-Elements 4.10.00 | RT |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Nikon | N-SIM/C2si | RT |
| Gas tank (5% CO2, 95% O2) | PENGYIDA | 40L | RT |
| Glass Bottom Confocal Dishes | Beyotime | FCFC020-10pcs | RT |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | RT |
| Glue | EVOBOND | KH-502 | RT |
| Ice machine | XUEKE | IMS-20 | RT |
| Image analysis software | National Institutes of Health | Image J | RT |
| Inhalation anesthesia system | SCIENCE | QAF700 | RT |
| Isolectin B 4-FITC | SIGMA | L2895–2MG | Store aliquots at –20 °C |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447–40–7 | RT |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | RT |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | RT |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647–14–5 | RT |
| NaH2PO4·H2O | Sigma-Aldrich | 10049–21–5 | RT |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | RT |
| Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318314 | RT |
| Peristaltic Pump | Scientific Industries Inc | Model 203 | RT |
| Propidium (Iodide) | Med Chem Express | HY-D0815/CS-7538 | Store aliquots at –20 °C |
| Stereotaxic apparatus | SCIENCE | QA | RT |
| Syringe pump | Harvard PUMP | PUMP 11 ELITE Nanomite | RT |
| Thermostatic water bath | OLABO | HH-2 | RT |
| Vibrating microtome | Leica | VT1200 | RT |
Riferimenti
- Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. Brain microvascular pericytes in health and disease. Acta Neuropathologica. 122 (1), 1-9 (2011).
- Dore-Duffy, P., Cleary, K. Morphology and properties of pericytes. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 686, 49-68 (2011).
- Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes. Nature. 443 (7112), 700-704 (2006).
- Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O’Farrell, F. M., Dalkara, T. What is a pericyte. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (2), 451-455 (2016).
- Yemisci, M., Gursoy-Ozdemir, Y., Vural, A., Can, A., Topalkara, K., Dalkara, T. Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery. Nature Medicine. 15 (9), 1031-1037 (2009).
- Korte, N., et al. Noradrenaline released from locus coeruleus axons contracts cerebral capillary pericytes via α2 adrenergic receptors. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2023).
- Hirunpattarasilp, C., Barkaway, A., Davis, H., Pfeiffer, T., Sethi, H., Attwell, D. Hyperoxia evokes pericyte-mediated capillary constriction. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 42 (11), 2032-2047 (2022).
- Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).
- Gong, Y., et al. Increased TRPM4 Activity in cerebral artery myocytes contributes to cerebral blood flow reduction after subarachnoid hemorrhage in rats. Neurotherapeutics: The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 16 (3), 901-911 (2019).
- Mai-Morente, S. P., et al. Pericyte mapping in cerebral slices with the far-red fluorophore TO-PRO-3. Bio-protocol. 11 (22), e4222 (2021).
- Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit. Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).
- Zhao, H., et al. Rationale for the real-time and dynamic cell death assays using propidium iodide. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (4), 399-405 (2010).
- Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. TO-PRO-3 iodide: A novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry. Cytometry. 17 (2), 185-189 (1994).
- Lacar, B., Herman, P., Platel, J. C., Kubera, C., Hyder, F., Bordey, A. Neural progenitor cells regulate capillary blood flow in the postnatal subventricular zone. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (46), 16435-16448 (2012).
- Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit. Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).
- Hezel, M., Ebrahimi, F., Koch, M., Dehghani, F. Propidium iodide staining: a new application in fluorescence microscopy for analysis of cytoarchitecture in adult and developing rodent brain. Micron (Oxford, England). 43 (10), 1031-1038 (2012).
- Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: An electron microscopic 3D reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).
