Imaging di periciti cerebrali vitali e non vitali in fette di cervello dopo emorragia subaracnoidea

Sommario

L'indagine preliminare conferma che l'emorragia subaracnoidea (SAH) provoca la morte dei periciti cerebrali. La valutazione della contrattilità dei periciti post-SAH richiede la differenziazione tra periciti cerebrali vitali e non vitali. Pertanto, è stata sviluppata una procedura per etichettare i periciti cerebrali vitali e non vitali contemporaneamente nelle sezioni cerebrali, facilitando l'osservazione utilizzando un microscopio confocale ad alta risoluzione.

Abstract

I periciti sono cellule murali cruciali situate all'interno della microcircolazione cerebrale, fondamentali per modulare attivamente il flusso sanguigno cerebrale attraverso aggiustamenti della contrattilità. Convenzionalmente, la loro contrattilità viene misurata osservando i cambiamenti morfologici e i cambiamenti del diametro capillare nelle vicinanze in circostanze specifiche. Tuttavia, la fissazione post-tissutale, la valutazione della vitalità e la conseguente contrattilità dei periciti cerebrali vengono compromessi. Allo stesso modo, l'etichettatura genetica dei periciti cerebrali non è in grado di distinguere tra periciti vitali e non vitali, in particolare in condizioni neurologiche come l'emorragia subaracnoidea (SAH), dove la nostra indagine preliminare convalida la morte dei periciti cerebrali. È stato messo a punto un protocollo affidabile per superare questi vincoli, consentendo l'etichettatura fluorescente simultanea di periciti cerebrali funzionali e non funzionali nelle sezioni cerebrali. Questo metodo di marcatura consente la visualizzazione al microscopio confocale ad alta risoluzione, marcando contemporaneamente la microvascolarizzazione della fetta di cervello. Questo protocollo innovativo offre un mezzo per valutare la contrattilità dei periciti cerebrali, il suo impatto sul diametro capillare e sulla struttura dei periciti. Lo studio della contrattilità dei periciti cerebrali all'interno del contesto SAH fornisce una comprensione approfondita dei suoi effetti sulla microcircolazione cerebrale.

Introduzione

I periciti cerebrali, che si distinguono per le loro sottili protuberanze e corpi cellulari sporgenti, circondano il microcircolo ^1,2. Mentre l'aumento del flusso sanguigno cerebrale è prevalentemente guidato dalla dilatazione capillare, le arterie più piccole mostrano tassi di dilatazione più lenti³. La contrattilità dei periciti esercita un'influenza sul diametro dei capillari e sulla morfologia dei periciti, influenzando la dinamica vascolare⁴. La contrazione dei periciti cerebrali porta alla costrizione capillare e, in scenari patologici, una contrazione ecce....

Protocollo

Il protocollo sperimentale è stato approvato dall'Animal Ethics and Use Committee della Kunming Medical University (kmmu20220945). Per il presente studio sono stati utilizzati ratti Sprague-Dawley (SD) di entrambi i sessi, 300-350 g.

1. Induzione del modello SAH

1. Anestetizzare i ratti usando il 2% di isoflurano e il 100% di ossigeno. Mantenere l'anestesia somministrando un'anestesia inalatoria continua con isoflurano (1%-3%). Fissare la testa del ratto con un apparecchio stereotassico (vedi Tabella dei materiali).
2. Creare il modello SAH attenendosi alla procedura riportata di seguito.
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Risultati

In condizioni fisiologiche normali, i periciti cerebrali generalmente non subiscono la morte cellulare. La figura 6 illustra questo fenomeno, con il giallo che indica la presenza di periciti cerebrali vitali; I periciti cerebrali non mostrano alcuna colorazione con PI, indicando la loro vitalità. Per indagare ulteriormente se i periciti rimangono attaccati alla microvascolarizzazione dopo la morte cellulare, sono stati impiegati metodi in un modello di ratto SAH e sono state condotte success.......

Discussione

Sono state sviluppate tecniche di imaging confocale ad alta risoluzione per la visualizzazione dei periciti cerebrali vitali, dei periciti cerebrali non vitali e della microvascolarizzazione in fette di cervello. Nelle fette acute di cervello di ratto, il processo comporta la marcatura iniziale dei periciti con TO-PRO-3¹¹, seguita da cellule endoteliali microvascolari con IB4¹²; successivamente, l'identificazione dei periciti deceduti viene condotta utilizzando PI. Questo p.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastra a 6 pozzetti	ABC biochimica	ABC703006
RT Adobe Photoshop	Adobe	Adobe Illustrator CS6 16.0.0	RT
Foglio di alluminio	MIAOJIE	225 mm x 273 mm
RT CaCl2· 2H2O	Sigma-Aldrich	C3881	RT
Software di imaging confocale	Nikon	NIS-Elements 4.10.00	RT
Microscopio a scansione laser confocale	Nikon	N-SIM/C2si	RT
Serbatoio del gas (5% CO2, 95% O2)	PENGYIDA	40L	RT
Piatti confocali con fondo in vetro	Beyotime	FCFC020-10 pezzi	RT
Glucosio	Sigma-Aldrich	G5767	RT
Colla	EVOBOND	KH-502	RT
Macchina per il ghiaccio	XUEKE	IMS-20	RT
Software di analisi delle immagini	National Institutes of Health	Image J	RT
Sistema di anestesia per inalazione	SCIENCE	QAF700	RT
Isolectin B 4- FITC	SIGMA	L2895– Aliquote del negozio 2MG	su – 20 ° C
KCl	Sigma-Aldrich	7447– 40– 7	RT
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662
RT MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506
RT NaCl	Sigma-Aldrich	7647– 14– 5	RT
NaH2PO4· H2O	Sigma-Aldrich	10049– 21– 5	RT
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761	RT
Pipetta	Pasteur NEST Biotechnology	318314	RT
Pompa peristaltica	Scientific Industries Inc	Modello 203	RT
Propidio (ioduro)	Med Chem Express	HY-D0815/CS-7538	Memorizza le aliquote su – 20 ° C
Apparecchio stereotassico	SCIENCE	QA	RT
Pompa a siringa	Harvard	PUMP PUMP 11 ELITE Nanomite	RT
Bagnomaria termostatico	OLABO	HH-2	RT
Microtomo vibrante	Leica	VT1200	RT