Den foreløpige undersøkelsen bekrefter at subaraknoidalblødning (SAH) forårsaker hjernepericyttdød. Evaluering av pericytkontraktilitet post-SAH krever differensiering mellom levedyktige og ikke-levedyktige hjernepericytter. Derfor er det utviklet en prosedyre for å merke levedyktige og ikke-levedyktige hjernepericytter samtidig i hjerneseksjoner, noe som letter observasjon ved hjelp av et høyoppløselig konfokalmikroskop.
Pericytter er viktige veggmalericeller som ligger i cerebral mikrosirkulasjon, sentrale i aktivt modulerende cerebral blodstrøm via kontraktilitetsjusteringer. Konvensjonelt måles deres kontraktilitet ved å observere morfologiske skift og nærliggende kapillærdiameterendringer under spesifikke omstendigheter. Likevel blir post-vevsfiksering, evaluering av vitalitet og påfølgende pericytkontraktilitet av avbildede hjernepericytter kompromittert. På samme måte kommer genetisk merking av hjernepericytter til kort når det gjelder å skille mellom levedyktige og ikke-levedyktige pericytter, spesielt i nevrologiske forhold som subaraknoidalblødning (SAH), hvor vår foreløpige undersøkelse validerer hjernens pericyttdød. En pålitelig protokoll er utviklet for å overvinne disse begrensningene, noe som muliggjør samtidig fluorescerende merking av både funksjonelle og ikke-funksjonelle hjernepericytter i hjerneseksjoner. Denne merkingsmetoden tillater høyoppløselig konfokalmikroskopvisualisering, samtidig som den markerer hjernesnittmikrovaskulaturen. Denne innovative protokollen gir et middel til å vurdere hjernens pericytkontraktilitet, dens innvirkning på kapillærdiameter og pericytstruktur. Undersøkelse av hjernens pericytkontraktilitet innenfor SAH-konteksten gir innsiktsfull forståelse av dens effekter på cerebral mikrosirkulasjon.
Hjernepericytter, preget av deres slanke fremspring og utstående cellelegemer, omkranser mikrosirkulasjonen 1,2. Mens cerebral blodstrømforstørrelse hovedsakelig drives av kapillær dilatasjon, viser mindre arterier langsommere utvidelseshastigheter3. Pericytkontraktilitet påvirker kapillærdiameter og pericytmorfologi, noe som påvirker vaskulær dynamikk4. Sammentrekning av hjernens pericytter fører til kapillær innsnevring, og i patologiske scenarier kan overdreven sammentrekning hindre erytrocytstrømmen5. Ulike faktorer, inkludert noradrenalin frigjort fra locus coeruleus, kan indusere hjernens pericyttkontraksjon i kapillærene6. Med en regulatorisk rolle i cerebral blodstrøm utviser pericytter 20-HETE syntese, som fungerer som en oksygensensor under hyperoksi7. Oksidativ-nitrativ stressutløst sammentrekning av hjernepericytter påvirker kapillærene negativt5. Til tross for både in vivo og ex vivo undersøkelser av hjernepericyttkontraksjon8, fortsetter begrenset kunnskap om avbildning av levedyktige og ikke-levedyktige hjernepericytter i hjerneskiver.
Avgjørende er at post-vevsfikseringsavbildning av hjernepericytter kompromitterer deres vitalitet og påfølgende kontraktilitetsvurdering. Videre, i scenarier som nevrologiske lidelser (f.eks. Subaraknoidalblødning – SAH), klarer ikke transgen merking av hjernepericytter å skille mellom levedyktige og ikke-levedyktige pericytter, som bekreftet av vår foreløpige SAH-induserte hjernepericyttdødsstudie9.
For å overvinne disse utfordringene brukte vi TO-PRO-3 for å merke levende pericytter, mens avdøde ble farget med propidiumjodid (PI). Vi brukte høyoppløselige konfokale bildebehandlingsteknologier for å visualisere levedyktige og ikke-levedyktige hjernepericytter i hjerneskiver samtidig som vi bevarte skiveaktivitet under avbildning. Denne artikkelen tar sikte på å presentere en reproduserbar metode for avbildning av levedyktige og ikke-levedyktige hjernepericytter i hjerneskiver, som tjener som et verdifullt verktøy for å undersøke virkningen av hjernepericytter på cerebral mikrosirkulasjon etter SAH.
Utviklet er høyoppløselige konfokale bildebehandlingsteknikker for å visualisere vitale hjernepericytter, ikke-vitale hjernepericytter og mikrovaskulaturen i hjerneskiver. I akutte hjerneskiver hos rotter innebærer prosessen innledende merking av pericytter med TO-PRO-311, etterfulgt av mikrovaskulære endotelceller med IB412; Deretter utføres identifisering av avdøde pericytter ved bruk av PI. Denne protokollen er enkel, reproduserbar og svært anvendelig for funksjo…
The authors have nothing to disclose.
Studien ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (81960226,81760223); Natural Science Foundation i Yunnan-provinsen (202001AS070045,202301AY070001-011)
6-well plate | ABC biochemistry | ABC703006 | RT |
Adobe Photoshop | Adobe | Adobe Illustrator CS6 16.0.0 | RT |
Aluminium foil | MIAOJIE | 225 mm x 273 mm | RT |
CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | RT |
Confocal imaging software | Nikon | NIS-Elements 4.10.00 | RT |
Confocal Laser Scanning Microscope | Nikon | N-SIM/C2si | RT |
Gas tank (5% CO2, 95% O2) | PENGYIDA | 40L | RT |
Glass Bottom Confocal Dishes | Beyotime | FCFC020-10pcs | RT |
Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | RT |
Glue | EVOBOND | KH-502 | RT |
Ice machine | XUEKE | IMS-20 | RT |
Image analysis software | National Institutes of Health | Image J | RT |
Inhalation anesthesia system | SCIENCE | QAF700 | RT |
Isolectin B 4-FITC | SIGMA | L2895–2MG | Store aliquots at –20 °C |
KCl | Sigma-Aldrich | 7447–40–7 | RT |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | RT |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | RT |
NaCl | Sigma-Aldrich | 7647–14–5 | RT |
NaH2PO4·H2O | Sigma-Aldrich | 10049–21–5 | RT |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | RT |
Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318314 | RT |
Peristaltic Pump | Scientific Industries Inc | Model 203 | RT |
Propidium (Iodide) | Med Chem Express | HY-D0815/CS-7538 | Store aliquots at –20 °C |
Stereotaxic apparatus | SCIENCE | QA | RT |
Syringe pump | Harvard PUMP | PUMP 11 ELITE Nanomite | RT |
Thermostatic water bath | OLABO | HH-2 | RT |
Vibrating microtome | Leica | VT1200 | RT |