Her beskrives en metode til at fodre Drosophila melanogaster med lægemidler og planteekstrakter og vurdere deres virkning på mave-tarmkanalen ved at analysere frugtfluernes fækale aflejringer. De lægemiddelbehandlede fluer kan bruges som model for videre forskning.
For at studere human gastrointestinal fysiologi har biomedicinske forskere påberåbt sig brugen af modelorganismer. Selvom mange forskere har brugt mus som model til at studere tarmfunktionen, har kun få rapporter fokuseret på Drosophila melanogaster (D. melanogaster). Sammenlignet med mus har bananfluer mange fordele, såsom en kort livscyklus, omkostningseffektiv og enkel vedligeholdelse og ingen etiske problemer. Desuden er pattedyrs gastrointestinale fysiologi, anatomi og signalveje stærkt bevaret i D. melanogaster. Planteekstrakter er traditionelt blevet brugt til behandling af diarré og forstoppelse. For eksempel er Psidium guajava (P. guajava) et af de mest kendte antidiarrheal midler i troperne. Imidlertid har ingen undersøgelser evalueret effekten af antidiarrheal og afføringsmidler og planteekstrakter i D. melanogaster, og det er fortsat ukendt, om lignende virkninger (fx mindre, mere koncentrerede og mindre rigelige fækale aflejringer i tilfælde af antidiarrheal medicin) kan forekomme i bananfluerne sammenlignet med pattedyr. I denne undersøgelse, en antidiarrheal effekt induceret af P. guajava er demonstreret i en D. melanogaster stamme, der præsenterer en diarrheic fænotype. Fækal prøveudtagning produceret af fluer overvåges ved hjælp af en farvestof-suppleret mad. Denne protokol skitserer den metode, der anvendes til tilberedning af mad med lægemidler, evaluering af fækale aflejringer af fluer fodret med disse tilberedninger og fortolkning af de opnåede data.
Mave-tarmkanalen (GI), også kaldet fordøjelseskanalen, er ansvarlig for fordøjelsen og absorptionen af næringsstoffer og udskillelse af ufordøjede produkter1. GI-kanalen er sårbar over for en række lidelser, der kan forårsage ubehag, smerte og forstyrrelse i det daglige liv. Gastrointestinale lidelser omfatter mavesmerter og ubehag, oppustethed, halsbrand, fordøjelsesbesvær eller dyspepsi, kvalme, opkastning, diarré og forstoppelse2. Diarré er det mest almindelige symptom på GI lidelse3, og det er defineret som en sygdom med mindst tre løs og vandig afføring i løbet af en 24 timers periode4. Diarré er forårsaget af en lang række patogener, herunder bakterier, vira, parasitter, svampe og kan også være forårsaget af lægemidler 5,6. På verdensplan er diarré fortsat den næststørste årsag til dødelighed blandt børn under 5 år7. Selvom diarré kan løse sig selv, kan det også indikere en mere alvorlig underliggende tilstand, hvis den varer i mere end et par dage.
For at studere tarmkanalen henvender forskere sig til dyremodeller som mus, rotter og svin 8,9. Brugen af disse dyr kan dog være dyrt og tidskrævende, fordi de kræver specialiserede faciliteter og etiske overvejelser. Nylige undersøgelser har vist, at D. melanogaster kan bruges som model til at studere mave-tarmkanalen og undersøge nogle mekanismer såsom vedligeholdelse af regenerativ homeostase, udvikling af immunældning, tab af epitelbarrierefunktion og faldet i metabolisk homeostase10,11. D. melanogaster, kendt som frugtfluen, deler en høj grad af genetisk homologi med mennesker; Ca. 75% af humane sygdomsgener menes at have en funktionel homolog i Fly12. De har også et simpelt fordøjelsessystem bestående af en forgut, en midgut og en bagtarm13. D. melanogaster er let at dyrke i laboratoriet og kan genetisk modificeres på forskellige måder14. Derfor er brug af D. melanogaster til in vivo-test et kraftfuldt værktøj, der giver forskere mulighed for at studere komplekse biologiske processer i kontrollerede omgivelser.
Ifølge Verdenssundhedsorganisationen (WHO) bruger omkring 80% af de mennesker, der bor i udviklingslande, traditionel medicin til deres primære sundhedsbehov15. Den høje brug af lægeplanter kan forklares ved, at de er let tilgængelige, billige og har få bivirkninger16. De vigtigste plantedele, der anvendes i urteterapi, omfatter blade, bark, rødder, frø17, mens de vigtigste fremstillingsmetoder er infusion, afkogning og maceration18. Disse naturlægemidler indeholder fytokemiske stoffer såsom alkaloider, terpenoider, flavonoider, steroider, tanniner og kulhydrater19, som har terapeutiske virkninger på menneskekroppen. Folk bruger en række medicinske planter til behandling af GI-lidelser som diarré, mavepine og dysenteri20. For eksempel er Psidium guajava en af de mest almindeligt anvendte planter til behandling af diarré i verden. Forskellige farmakologiske og kliniske tests har allerede vist dets sikkerhed, hvilket gør det til en god antidiarrheal kandidat til at studere21,22. De største begrænsninger ved plantelægemidler er imidlertid manglen på effektivitets- og sikkerhedsvurdering samt manglen på konkrete og fuldstændige oplysninger om sammensætningen af de anvendte planteekstrakter23. For at validere plantelægemidlers effektivitet og sikkerhed er der behov for en systematisk tilgang med eksperimentel og klinisk validering, og tilgangen bør understøttes af tilstrækkelige data fra in vivo- og in vitro-undersøgelser.
For at evaluere traditionelle midler til deres effektivitet i behandlingen af diarré har brugen af mus og rotter været fremherskende i de seneste årtier24,25. På grund af de tidligere nævnte vigtigste fordele, dvs. brugervenlighed, overkommelige, replikerbare, bevarede absorberende og fordøjelsesfunktioner mellem fluer og pattedyr, foreslår vi at anvende D. melanogaster som model til evaluering af planters antidiarrheale aktivitet. Den diarrheiske fænotype i D. melanogaster kan karakteriseres af flere funktioner, herunder øget overflod af fækale aflejringer, større aflejringsstørrelser, en lysere farve (mindre koncentreret) og højere fækal materiale26. Denne fænotype kan kvantificeres ved hjælp af forskellige parametre: antal fækale aflejringer, samlet areal af aflejringer, gennemsnitlig lethed og total integreret optisk tæthed (IOD). Total IOD defineres som det samlede farveindhold i aflejringen, hvilket betyder det samlede fækale materiale udskilt27. Tidligere er der udviklet et assay til analyse af fækale aflejringer af D. melanogaster27,28. I dette assay blev den ultimative læser af gødning (T.U.R.D.) brugt som et fækal analyseværktøj, som gør det muligt at kontrollere antallet, størrelsen og letheden af fækale aflejringer og dermed overvåge bananfluernes tarmfysiologi. Denne metode blev imidlertid aldrig anvendt til at evaluere den diarrheiske fænotype hos fluer. Ion Transport Peptide (ITP) genet er en vigtig endokrin regulator af tørst og udskillelse og kombinerer vand homeostase med fodring i D. melanogaster. I en nylig undersøgelse blev det vist, at hastigheden af fødevaretransit gennem mave-tarmkanalen og hyppigheden af afføringshændelser blev reduceret af ITP-overekspression og øget ved ITP-knockdown. Sidstnævnte fænotype blev beskrevet som diarrheisk af forfatterne af denne undersøgelse29.
I denne protokol, en modificeret version af fækal depositum assay anvendes til at vurdere virkningen af en antidiarrheal agent (dvs, guava blade ekstrakt) på mave-tarmkanalen af D. melanogaster ved hjælp af ITPi stamme som en diarrheic model. Det overordnede mål med denne metode er: 1) at give en nem og pålidelig metode til at evaluere antidiarrheal effekt af lægemidler og planteekstrakter, og 2) at tillade opdagelsen af bioaktive forbindelser, der er ansvarlige for antidiarrheal effekt i planteekstrakter ved at anvende en bioaktivitetsstyret tilgang.
D. melanogaster er blevet bredt accepteret som model for forskellige biologiske processer på grund af ligheden i gener mellem D. melanogaster og mennesker36. Brugen af D. melanogaster som model til undersøgelse af tarmkanalen er udbredt, og anvendelsen af T.U.R.D. er blevet brugt til at estimere antallet, arealet og mængden af fækale aflejringer. Imidlertid er den fænotypiske detektionsmetode ikke blevet brugt til at vurdere diarré hos bananfluer. Derfor introducerer denne protokol en ny metode til groft at vurdere tilstedeværelsen af diarré ved at detektere fækale aflejringer.
Fækale aflejringer er en væsentlig indikator for tarmkanalens funktion og sundhed37. I denne sammenhæng foreslås en metode til opdræt af D. melanogaster på lægemiddelholdigt medium for at undersøge forskellige parametre for fækale aflejringer. Ved at overvåge antallet af aflejringer er det muligt at bestemme hyppigheden af afføring og vurdere, om et lægemiddel har nogen indflydelse på tarmtransiteringen. Det samlede areal af aflejringerne kan måles for at evaluere koncentrationen og fortyndingen af fækalt stof, hvilket er en vigtig faktor til bestemmelse af tarmkanalens generelle sundhed. Derudover kan den samlede integrerede optiske tæthed (IOD) bruges til at detektere den samlede mængde fækalt materiale, der er til stede i aflejringerne. Denne protokol giver en effektiv metode til at screene og evaluere lægemidler samt planteekstrakter, der påvirker tarmkanalen. Når D. melanogaster anvendes som modelorganisme, er det muligt at vurdere effektiviteten af potentielle lægemidler, hvilket kan bidrage til at fremskynde lægemiddelopdagelsesprocessen. Ved at anvende denne metode på planteekstrakter kan forskere hjælpe med at validere deres anvendelse som antidiarrheal agenter.
Der er flere kritiske trin at overveje, når du bruger denne protokol til at studere fækale aflejringer i D. melanogaster. For det første er det vigtigt at beregne den masse, der kræves for at opnå den ønskede koncentration af lægemidlet i mediet. Desuden er det vigtigt at sikre god forberedelsestilstand, når lægemidlet tilsættes til mediet, da høje temperaturer kan nedbryde lægemidlet og påvirke dets styrke. For det andet er udvælgelsen af kvindelige fluer vigtig i denne protokol. Det er vigtigt at bruge jomfru kvindelige fluer for at undgå forskellene i fækal produktion mellem jomfru og parret hunner. For eksempel er pletterne produceret af jomfruhunner mere cirkulære end parrede hunner, og parrede hunner har tendens til at udskille mere fækalt materiale end jomfruhunner27,28. Derfor anbefales det at indsamle fluer inden 8 timers lukning for at sikre, at alle indsamlede hunner er jomfruer. Derudover skal de testede fluer være stærke og sunde, da deres helbred kan påvirke fødeindtagelse og fækal produktion. For eksempel kan fluer med en anormal form af vinger have svært ved at få maden. Endelig, for at bruge T.U.R.D. med succes, er blokstørrelsen (pixels) og forskydningsindstillingerne afgørende. På grund af forskellen i billedernes lyskontrast kan det være nødvendigt at prøve forskellige indstillinger for at opnå den bedst mulige identifikation af fækale aflejringer.
Selvom den præsenterede metode er effektiv, er der flere begrænsninger. Den ene er nøjagtigheden af lægemiddelkoncentrationen i mediet. Da mediet opvarmes under fremstillingen, kan noget vand fordampe, hvilket kan påvirke koncentrationen af lægemidlet. En anden begrænsning er scanningen af petriskålene. Nogle dele af petriskålene (dvs. kanter) scannes ikke, og dette kan resultere i en fejlberegning af de samlede fækale aflejringer. Derudover producerer fluerne ikke den samme mængde fækale aflejringer på petriskålenes øverste og nederste dæksler. Fordi de har tendens til at producere flere aflejringer på bunddækslet, kan standardafvigelsen i analysen mellem top- og bunddækslet være høj, hvilket kan påvirke nøjagtigheden af resultaterne.
Ved hjælp af denne protokol kan forskere studere diarré i D. melanogaster. Ved at ændre det lægemiddelholdige medium kan denne metode bruges til at screene antidiarrheal planter, hvilket giver en ny tilgang til lægemiddelopdagelse. Traditionel medicin og naturlige produkter er blevet brugt i århundreder til behandling af forskellige sygdomme, herunder gastrointestinale lidelser. Ved at bruge denne protokol til at evaluere effektiviteten af planteekstrakter på fækale aflejringer kan potentielle nye behandlinger for tarmlidelser identificeres, og der kan gives en videnskabelig begrundelse for deres anvendelse som antidiarrheal agent. Denne tilgang kan yde et værdifuldt bidrag til området for lægemiddelopdagelse og etnofarmakologi.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Martina Gáliková for at give os Drosophila-stammerne . Vi er taknemmelige for Michelle Crozatier-Borde og Marc Haenlin-teamet for at give feedback på vores undersøgelse og hjælpe os med at forbedre vores model. Vi vil gerne takke Napo Pharmaceuticals Company for at give os lægemidlet Crofelemer. Forfatterne er også taknemmelige over for gæsteredaktøren Dr. Hugues Petitjean for at give os mulighed for at offentliggøre denne protokol. Denne undersøgelse blev finansieret af Agence Nationale de la Recherche (ANR) under projektet ANR-22-CE03-0001-01.
Chemical & Food medium | |||
Agar | Sigma Aldrich | A7002 | 5 Kg bucket |
Bromophenol blue | Sigma Aldrich | 34725-61-6 | B5525-25G |
Corn flour | Nature et Cie | *910007 | 25 Kg bag |
Crofelemer | Napo pharmaceuticals | – | – |
Ethanol 96% | – | – | – |
Loperamide | Sigma Aldrich | L4762 | 5 grams |
Moldex | VWR | 1.06757.5000 | 5 Kg bag |
Propionic acid | Dutscher | 409553-CER | 1 Liter bottle |
Sugar | Pomona EpiSaveurs | 52705 | 1 Kg bag |
Yeast | Dutscher | 789195 | 10 Kg bag |
Materials | |||
Beaker | DWK LIFE SCIENCE | – | 250 mL |
Centrifugation tube | Eppendorf | 30119401 | Eppendorf tubes 5.0 mL |
CO2 tank | – | – | – |
Erlen Meyer flask | – | – | 500 mL (for extraction) |
Filter paper grade | Whatman | – | 3 mm chr. |
Flowbuddy socle | Genesis | – | – |
Flugs Narrow Plastic vials | Genesis | 49-102 | – |
Flystuff Blow gun | Genesis | – | – |
Flystuff Ultimate Flypad | Genesis | – | – |
Flystuff Foot pedal | Genesis | – | – |
Forceps | Dumostar | 11295-51 | – |
Graduated cylinder | – | – | 100 mL |
Inox spatula | – | – | – |
Micropipette | Eppendorf | 4924000088 | Eppendorf Reference 2 |
Micropipette tip | Eppendorf | 30000919 | epT.I.P.S. Standard |
Narrow Drosophila vials | Genesis | 32-120 | – |
Paintbrush | – | – | – |
Petri dish | Greiner | 628162 | Size: 60 x 15mm |
Round-bottom flask | – | – | 500 mL (for evaporation) |
Thermometer | Avantor | 620-0916 | |
Whisk | – | – | – |
Equipments | |||
Chiller | HUBER | Minichiller | – |
Heating bath | BÜCHI | B-490 | – |
Heating plate | BIOBLOCK SCIENTIFIC | – | Magnetic stirrer hot plate |
Incubator | Memmert | – | HPP110eco |
Rotary evaporator | BÜCHI | R-200 | – |
Scanner | Epson | V850 pro | – |
Shaker | Edmund Bühle | KS 10 | – |
Stereomicroscope binocular | Zeiss | Stemi 305 | – |
Vacuum pump | VACUUBRAND | PC500 series | – |
Vortex mixer | Sigma Aldrich | CLS6776-1EA | Corning LSE vortex mixers |
Weighing scale | OHAUS Scout | SKX622 | – |