Valutazione dell'effetto dei farmaci antidiarroici e degli estratti vegetali sulla Drosophila melanogaster

Summary

Qui viene descritto un metodo per nutrire la Drosophila melanogaster con farmaci ed estratti vegetali e valutare il loro effetto sul tratto gastrointestinale analizzando i depositi fecali dei moscerini della frutta. Le mosche trattate con farmaci possono essere utilizzate come modello per ulteriori ricerche.

Abstract

Per studiare la fisiologia gastrointestinale umana, gli scienziati biomedici si sono affidati all'uso di organismi modello. Sebbene molti ricercatori abbiano utilizzato i topi come modello per studiare la funzione intestinale, solo pochi rapporti si sono concentrati sulla Drosophila melanogaster (D. melanogaster). Rispetto ai topi, i moscerini della frutta presentano molti vantaggi, come un ciclo di vita breve, una manutenzione semplice ed economica e nessun problema etico. Inoltre, la fisiologia, l'anatomia e le vie di segnalazione gastrointestinali dei mammiferi sono altamente conservate in D. melanogaster. Gli estratti vegetali sono stati usati tradizionalmente per trattare la diarrea e la stitichezza. Ad esempio, lo Psidium guajava (P. guajava) è uno degli agenti antidiarroici più conosciuti ai tropici. Tuttavia, nessuno studio ha valutato l'effetto dei farmaci antidiarroici e lassativi e degli estratti vegetali in D. melanogaster, e non è noto se effetti simili (ad esempio, depositi fecali più piccoli, più concentrati e meno abbondanti nel caso di farmaci antidiarroici) possano verificarsi nei moscerini della frutta rispetto ai mammiferi. In questo studio, è stato dimostrato un effetto antidiarroico indotto da P. guajava in un ceppo di D. melanogaster che presenta un fenotipo diarroico. Il campionamento fecale prodotto dalle mosche viene monitorato utilizzando un alimento integrato con colorante. Questo protocollo delinea il metodo utilizzato per la preparazione degli alimenti con i farmaci, valutando i depositi fecali delle mosche nutrite con queste preparazioni alimentari e interpretando i dati ottenuti.

Introduction

Il tratto gastrointestinale (GI), chiamato anche tratto digestivo, è responsabile della digestione e dell'assorbimento dei nutrienti e dell'escrezione dei prodotti non digeriti¹. Il tratto gastrointestinale è vulnerabile a una serie di disturbi che possono causare disagio, dolore e interruzione della vita quotidiana. I disturbi gastrointestinali includono dolore e disagio addominale, gonfiore, bruciore di stomaco, indigestione o dispepsia, nausea, vomito, diarrea e stitichezza². La diarrea è il sintomo più comune del disturbo gastrointestinale³ ed è definita come una malattia con almeno tre feci molli e acquose durante un periodo di 24 ore⁴. La diarrea è causata da una vasta gamma di agenti patogeni, tra cui batteri, virus, parassiti, funghi e può anche essere causata da farmaci ^5,6. In tutto il mondo, la diarrea continua a essere la seconda causa di mortalità tra i bambini sotto i 5 anni⁷. Sebbene la diarrea possa risolversi da sola, può anche indicare una condizione sottostante più grave se dura per più di qualche giorno.

Per studiare il tratto intestinale, i ricercatori si rivolgono a modelli animali come topi, ratti e maiali ^8,9. Tuttavia, l'uso di questi animali può essere costoso e dispendioso in termini di tempo perché richiedono strutture specializzate e considerazioni etiche. Studi recenti hanno dimostrato che D. melanogaster può essere utilizzato come modello per studiare il tratto gastrointestinale e indagare alcuni meccanismi come il mantenimento dell'omeostasi rigenerativa, lo sviluppo della senescenza immunitaria, la perdita della funzione di barriera epiteliale e il declino dell'omeostasi metabolica^10,11. D. melanogaster, noto come moscerino della frutta, condivide un alto grado di omologia genetica con l'uomo; Si ritiene che circa il 75% dei geni delle malattie umane abbia un omologo funzionale nella mosca¹². Hanno anche un semplice apparato digerente costituito da un intestino anteriore, un intestino medio e un intestino posteriore¹³. D. melanogaster è facile da coltivare in laboratorio e può essere geneticamente modificato in diversi modi¹⁴. Pertanto, l'utilizzo di D. melanogaster per i test in vivo è un potente strumento che consente ai ricercatori di studiare processi biologici complessi in un ambiente controllato.

Secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), circa l'80% delle persone che vivono nei paesi in via di sviluppo utilizza la medicina tradizionale per le proprie esigenze sanitarie primarie¹⁵. L'elevato uso di piante medicinali può essere spiegato dal fatto che sono facilmente reperibili, poco costose e hanno pochi effetti collaterali¹⁶. Le principali parti della pianta utilizzate in erboristeria includono foglie, corteccia, radici, semi¹⁷ mentre i principali metodi di preparazione sono l'infusione, il decotto e la macerazione¹⁸. Questi rimedi erboristici contengono sostanze fitochimiche come alcaloidi, terpenoidi, flavonoidi, steroidi, tannini e carboidrati¹⁹, che hanno effetti terapeutici sul corpo umano. Le persone usano una varietà di piante medicinali per trattare i disturbi gastrointestinali come diarrea, mal di stomaco e dissenteria²⁰. Ad esempio, il Psidium guajava è una delle piante più comunemente usate per trattare la diarrea nel mondo. Vari test farmacologici e clinici hanno già dimostrato la sua sicurezza, il che lo rende un buon candidato antidiarroico da studiare ^21,22. Tuttavia, i principali limiti dei medicinali a base di erbe sono la mancanza di una valutazione dell'efficienza e della sicurezza, nonché la mancanza di informazioni certe e complete sulla composizione degli estratti vegetali utilizzati²³. Per convalidare l'efficacia e la sicurezza dei medicinali a base di erbe, è necessario un approccio sistematico che preveda la convalida sperimentale e clinica e l'approccio dovrebbe essere supportato da dati sufficienti provenienti da studi in vivo e in vitro.

Per valutare la loro efficacia nei rimedi tradizionali nel trattamento della diarrea, l'uso di topi e ratti è stato predominante negli ultimi decenni^24,25. A causa dei principali vantaggi menzionati in precedenza, ovvero facilità d'uso, funzioni di assorbimento e digestione tra mosche e mammiferi, economiche, replicabili, conservate, proponiamo di utilizzare D. melanogaster come modello per valutare l'attività antidiarroica delle piante. Il fenotipo diarroico in D. melanogaster può essere caratterizzato da diverse caratteristiche, tra cui una maggiore abbondanza di depositi fecali, dimensioni maggiori dei depositi, una colorazione più chiara (meno concentrata) e materiale fecale più elevato²⁶. Questo fenotipo può essere quantificato utilizzando vari parametri: numero di depositi fecali, area totale dei depositi, luminosità media e densità ottica integrata totale (IOD). L'IOD totale è definito come il contenuto totale di colorante del deposito, ovvero il materiale fecale totale escreto²⁷. In precedenza, è stato sviluppato un test per analizzare i depositi fecali di D. melanogaster^27,28. In questo test è stato utilizzato come strumento di analisi fecale il lettore finale di sterco (T.U.R.D.), che permette di verificare il numero, la dimensione e la leggerezza dei depositi fecali e quindi di monitorare la fisiologia intestinale dei moscerini della frutta. Tuttavia, questo metodo non è mai stato applicato per valutare il fenotipo diarroico nei moscerini. Il gene del peptide di trasporto ionico (ITP) è un importante regolatore endocrino della sete e dell'escrezione e combina l'omeostasi dell'acqua con l'alimentazione in D. melanogaster. In uno studio recente, è stato dimostrato che la velocità di transito del cibo attraverso il tratto gastrointestinale e la frequenza degli eventi di defecazione sono state diminuite dalla sovraespressione di ITP e aumentate dal knockdown di ITP. Quest'ultimo fenotipo è stato descritto come diarroico dagli autori di questo studio²⁹.

In questo protocollo, viene impiegata una versione modificata del test del deposito fecale per valutare l'effetto di un agente antidiarroico (ad esempio, l'estratto di foglie di guava) sul tratto gastrointestinale di D. melanogaster utilizzando il ceppo ITPi come modello diarroico. L'obiettivo generale di questo metodo è: 1) fornire un metodo semplice e affidabile per valutare l'effetto antidiarroico di farmaci ed estratti vegetali, e 2) consentire la scoperta di composti bioattivi responsabili dell'effetto antidiarroico negli estratti vegetali applicando un approccio guidato dalla bioattività.

Protocol

1. Preparazione dell'estratto vegetale

1. Raccogli le foglie di Psidium guajava L.³⁰ da un albero adulto e procedi come segue: asciugare le foglie in forno a 40 °C per 6 giorni, quindi asciugare all'aria per 6 giorni, quindi asciugare di nuovo in forno a 40 °C per 4 giorni e infine preparare la polvere di foglie macinando le foglie secche in un macinino o in un macinacaffè.
2. Macerare 100 g di polvere essiccata in 1 L di etanolo al 96% per 24 ore, agitando continuamente con uno shaker. Sottoporre nuovamente i residui vegetali allo stesso processo ed evaporare i filtrati risultanti a secco utilizzando un evaporatore rotativo sottovuoto a pressione ridotta (175 mbar) a 40 °C.
3. Sciogliere l'estratto vegetale in etanolo per ottenere la concentrazione desiderata. Determinare la concentrazione ottimale (utilizzando il protocollo qui descritto) testando una serie di concentrazioni.
   1. Per gli estratti vegetali, testare un intervallo di concentrazione di 100 μg/mL, 1 mg/mL, 10 mg/mL, 100 mg/mL e utilizzare quelli che non influenzano il tasso di sopravvivenza della mosca. Per i composti puri, testare il seguente intervallo di concentrazioni: 0,05, 0,5, 5 e 50 mM¹².

2. Preparazione del terreno alimentare

1. Misurare 100 ml di acqua distillata e versare nel becher con 4 g di zucchero e 0,8 g di agar (vedi Tabella dei materiali). Scaldare a 100 °C (mescolando) e tenere premuto per 10 min.
2. Abbassare la temperatura a 80 °C, aggiungere 7,4 g di farina e 2,8 g di lievito mescolando. Scaldare per almeno 20 min, sempre mescolando e controllando la temperatura che dovrebbe essere intorno agli 80 °C.
3. Aggiungere la soluzione di acido propionico moldex (1 mL di moldex e 0,3 g di acido propionico mescolare bene). Attendere che la temperatura scenda a circa 50 °C, aggiungere la soluzione di estratto vegetale (1 mg/mL) e 0,5 g di polvere blu di bromofenolo.
   NOTA: Fare riferimento al paragrafo 1.3.1 per maggiori dettagli sulle altre concentrazioni da testare.
4. Versare il cibo nelle piastre di Petri e fermarsi quando la capsula di Petri è piena (Figura 1A). Lasciare raffreddare le piastre di Petri a temperatura ambiente (circa 3 h), quindi chiudere il coperchio e conservare in frigorifero a 4 °C.
   NOTA: Le piastre di Petri devono essere conservate in frigorifero per non più di 2 settimane per evitare l'evaporazione dell'acqua.

Figura 1: Dimostrazione del processo sperimentale per il test del deposito fecale. (A) Immagine che mostra piastre di Petri piene di terreno alimentare. Assicurati di avere abbastanza cibo nella capsula di Petri, in modo che nessuna fessura intrappoli le mosche e impedisca loro di muoversi. Tuttavia, non sovraccaricare la capsula di Petri con il cibo in modo che la superficie possa essere coperta in modo uniforme. (B) Immagine della spatola come descritto nel protocollo. (C) Immagine del test del deposito fecale come descritto nel protocollo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Preparare le mosche

1. Preparare i serbatoi di CO₂ , la pistola ad aria compressa di CO₂ con aghi, tampone antimosche, pennello e microscopio. La stazione di volo fornisce CO₂ sia al fly pad che alla pistola di soffiaggio. Il fly pad viene utilizzato per lo smistamento delle mosche, mentre la pistola ad aria compressa CO₂ viene utilizzata per anestetizzare le mosche in fiale, bottiglie e piastre di Petri.
2. Standardizzare l'età delle mosche selezionando fiale che contengono pupe (almeno 10) e scartare le mosche adulte dal tubo utilizzando il seguente metodo. Uno per uno, capovolgere i flaconcini e inserire l'ago tra il tappo di cotone e la parete laterale del flaconcino. Anestetizzare le mosche adulte con la pistola ad aria compressa CO₂ fino a quando tutte le mosche non si sono addormentate sul tappo di cotone (sono necessari alcuni secondi per anestetizzarle e l'azione anestetica durerà per alcuni secondi dopo aver rilasciato la pistola ad aria compressa). Aprire il flaconcino sopra una bottiglia di vetro contenente il 70% di etanolo e lasciarvi cadere le mosche. Chiudere il flaconcino con il tappo di cotone e conservarlo in un'incubatrice a 25 °C con il 60% di umidità. Impostare il ciclo di luce dell'incubatrice su 12 h luce/12 h buio.
3. Dopo l'incubazione (massimo 8 ore), classificarli in femmine e maschi vergini al microscopio e al tappetino girandoli sulla schiena e osservando i loro genitali.
   1. I genitali femminili sono pallidi rispetto ai genitali maschili, che sono di colore rossastro. I maschi possono anche essere identificati dalla presenza di setole scure, chiamate pettini sessuali, sul paio di zampe anteriori. Dividere le mosche in due provette fresche (una per i maschi e una per le femmine) e incubarle per 6-8 giorni a 25 °C.
      NOTA: A 25 °C, le femmine rimangono vergini per circa 8 ore dopo la schiusa.

4. Test del deposito fecale

1. Etichettare le piastre di Petri con il ceppo, il sesso e il farmaco corrispondenti per evitare confusione tra le piastre di Petri. Impilare le piastre di Petri una sopra l'altra.
2. Prendi le piastre di Petri contenenti il cibo colorato e capovolgile sulla carta assorbente per assorbire il liquido in eccesso. Usando una spatola (Figura 1B), tagliare il cibo in 12 parti uguali e poi usare la spatola per mettere una fetta in una capsula di Petri vuota.
   NOTA: A seconda del numero di repliche, il numero di fette da tagliare può essere aumentato fino a 20 per capsula di Petri. Ogni fetta deve essere della stessa dimensione.
3. Anestetizzare le mosche con CO₂ fino a quando tutte le mosche non si sono addormentate sul batuffolo di cotone. Trasferisci sei mosche sane in ciascuna capsula di Petri (Figura 1C) e chiudi immediatamente il coperchio, quindi mettile nell'incubatrice (25°C, 60% di umidità, 12 h di luce/12 h di buio).
4. Per garantire che le mosche non fuoriescano dalla capsula di Petri durante l'esperimento, fissare i coperchi superiore e inferiore della capsula di Petri con un nastro adesivo. Per ogni gruppo di test, preparare almeno sei piastre di Petri replicate.
5. Dopo aver lasciato che le mosche si impennino per 24 ore, utilizzare la CO₂ per anestetizzarle, trasferire le mosche in un contenitore riempito con etanolo al 70% e smaltire il cibo rimanente.
6. Conservare le piastre di Petri e procedere al passaggio 5.

5. Quantificazione delle piastre di Petri

1. Imposta una cartella sul computer e rinominala, includendo il nome del ceppo dell'esperimento, il sesso delle mosche e il tipo di farmaci utilizzati. All'interno di questa cartella, creare sottocartelle denominate Originale, Taglio e Analisi.
2. Scansiona le piastre di Petri utilizzando uno scanner ad alta risoluzione con una risoluzione ottica di 6.400 pixel per pollice (ppi). Eseguire la scansione dei coperchi superiore e inferiore di ciascuna capsula di Petri separatamente posizionandoli singolarmente al centro del campo dello scanner.
3. Aprire l'applicazione installata sul computer. Sullo schermo del computer si aprirà una finestra di benvenuto con tutte le impostazioni generali (Figura 2A).
   NOTA: Non modificare le impostazioni avanzate. Questo passaggio è valido solo per gli utenti che dispongono dello stesso scanner proposto nella Tabella dei Materiali. Si prega di fare riferimento alle linee guida se si utilizza un altro software.
   1. Assegnare un nome alla capsula di Petri nell'applicazione, includendo il numero di sequenza, il coperchio superiore o inferiore, il sesso e il tipo di alimento utilizzato. Selezionare il set originale della sottocartella al punto 5.1.
   2. Visualizzare l'anteprima della piastra di Petri. Fare clic su Anteprima nella parte inferiore della finestra, attendere alcuni secondi per la pre-scansione dello scanner, quindi sullo schermo del computer viene visualizzata una finestra. Sposta il quadrato visualizzato sullo schermo per circondare la capsula di Petri.
   3. Fare clic su Scansione in basso a destra della finestra sullo schermo del computer, la scansione viene automaticamente salvata come immagine nella cartella scelta.
4. Ritaglia l'immagine utilizzando un'applicazione (ad esempio, l'applicazione open-source Fiji), in modo che nessun artefatto e residuo di cibo venga considerato come deposito.
   NOTA: I seguenti passaggi sono validi solo per gli utenti che dispongono dell'applicazione Fiji. Si prega di fare riferimento alle linee guida se si utilizza un altro software.
   1. Apri l'applicazione Fiji, attendi qualche secondo finché sullo schermo non viene visualizzata una barra degli strumenti.
   2. Trascinare l'immagine da ritagliare sulla barra degli strumenti. Seleziona la 3a icona Selezioni poligonali nella barra degli strumenti, ritaglia la parte indesiderata della foto (il grafico a torta colorato) facendo clic sullo schermo per contrassegnare un angolo attorno al grafico a torta (Figure 2B-1,2).
      NOTA: Quando si delinea l'area di ritaglio all'interno di un'immagine, è fondamentale che i fotogrammi scelti siano collegati senza soluzione di continuità end-to-end.
   3. Fare clic su Modifica in alto a sinistra della barra, quindi su Riempimento/Cancella all'esterno (Figura 2B-3).
   4. Per salvare la foto, clicca su File in alto a sinistra della barra, poi su Salva con nome e infine su Tiff. Scegliere il set di sottocartelle Cut nel passaggio 5.1.
      NOTA: Quando si salva l'immagine ritagliata, assicurarsi che nel nome del file non siano presenti caratteri speciali (ad esempio, !, &, $, #, _,-,...) o troppi caratteri.

Figura 2: Passaggi chiave nel processo di analisi dei dati del test del deposito fecale. (A) Screenshot che mostra le informazioni di impostazione dell'applicazione di scansione. (B) Immagini ritagliate utilizzando l'applicazione Figi. Assicurarsi che nessun manufatto e residuo di cibo sia considerato deposito. (C) Screenshot che mostra come appare quando si apre l'applicazione Excel_merge-v4. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

6. Identificazione dei depositi fecali utilizzando il software open source Ultimate Reader of D-Age

NOTA: L'introduzione e l'uso del software per il lettore definitivo di letame si trovano nel file supplementare 1.

1. Innanzitutto, aprire il software T.U.R.D. (Figura 1 supplementare). Creare un nuovo esperimento e assegnare un nome al documento, quindi salvarlo nella sottocartella Analysis set nel passaggio 5.1.
2. Fare clic su Piastre e poi su Aggiungi piastra. Selezionare la capsula di Petri da elaborare. Viene visualizzata una nuova finestra con i nomi delle piastre selezionate e dei nuovi parametri. Impostare la dimensione del blocco, l'offset, la dimensione minima e la dimensione massima (Figura 2 supplementare).
3. Per verificare che i depositi fecali rilevati siano quelli corretti, fare clic su Piastre, quindi su Ispeziona piastre selezionate, quindi su Grafica e Visualizza immagini annotate (Figura 3 supplementare). Ingrandisci e guarda i conteggi. Se sono presenti solo pochi depositi che non devono essere inclusi nell'analisi, deselezionare i depositi da escludere (Figura 4 supplementare).
4. Per ogni nuova immagine da elaborare, riavviare dal passaggio 6.3.
5. Dopo aver analizzato le piastre con il software T.U.R.D., modificare il numero di mosche cliccando su No. mosche (figura supplementare 5).
6. Modificare il nome del gruppo facendo clic su Piatti > Modifica gruppi > Aggiungi, quindi sulla colonna Gruppo scegliere il nome del gruppo.
7. Esportare separatamente i diversi dati di replica facendo clic su Analizza > Statistiche descrittive > Seleziona gruppo (Figura 6 supplementare). Conserva tutti i file del foglio di calcolo (.csv) nella stessa cartella.
8. Per raccogliere tutti i file (ottenuti nel passaggio 6.7) in un unico foglio di calcolo, aprire l'applicazione Excel_merge-v4 (Supplementary Coding File 1), attendere fino a quando non viene visualizzata la seguente frase Selezionare il percorso della cartella (con .csv file):, quindi incollare l'indirizzo della cartella precedente. Ad esempio, il percorso potrebbe essere C:\Experiment\Fecal deposit test\, quindi fare clic su Invio due volte sulla tastiera (Figura 2C). Successivamente, viene creato un nuovo file di foglio di calcolo nella stessa cartella. Il nuovo foglio di calcolo include tutti i file esportati in fogli diversi.
9. Nel foglio di calcolo precedente, aggiungi un altro foglio per raccogliere la media di ogni parametro di tutte le repliche (usa la funzione CERCA.VERT per elaborare i dati). Un esempio è riportato nella tabella supplementare 1.
10. Analizza il valore p.

Results

Lo studio qui presentato mostra che la misurazione della diarrea in D. melanogaster può essere ottenuta attraverso l'uso del test del deposito fecale. Differenze significative tra i fenotipi (diarroici o meno) possono essere determinate analizzando vari parametri, tra cui il numero di depositi fecali, l'area totale dei depositi, l'area media dei depositi, la luminosità media e la densità ottica integrata totale (IOD), che è una misura della quantità totale di colorante presente nel deposito e rappresenta il contenuto totale di materiale fecale escreto²⁷.

Il knockdown del gene ITP nei moscerini può indurre un fenotipo diarroico, caratterizzato da una maggiore frequenza di defecazione, rendendoli un modello adatto per lo studio della diarrea²⁹. Nell'ambito di questo esperimento, il ceppo ITPi (w¹¹¹⁸; daughterless-GeneSwitch, UAS-ITPi /(CyO)) è stato impiegato e allevato su un terreno standard. L'estratto di foglie di Psidium guajava è stato selezionato come intervento antidiarroico, dato l'uso diffuso di questa pianta nelle regioni tropicali per gestire la diarrea. Crofelemer, un agente antidiarroico, è stato approvato dalla Food and Drug Administration (FDA) statunitense per fornire sollievo sintomatico per la diarrea non infettiva in pazienti adulti con HIV/AIDS sottoposti a terapia antiretrovirale³¹. Crofelemer è un estratto del lattice di Croton lechleri Müll.Arg. corteccia del fusto³². La loperamide è un farmaco sintetico utilizzato in tutto il mondo per trattare la diarrea³³. Sia Crofelemer che Loperamide sono stati utilizzati come potenziali controlli positivi.

L'ipotesi era che nutrire le mosche con estratto di P. guajava , Crofelemer e Loperamide avrebbe ridotto il fenotipo diarroico rispetto a quelle alimentate con cibo normale. Per esaminare questa ipotesi, è stata eseguita una misurazione dei depositi fecali in D. melanogaster confrontando diversi parametri tra le mosche alimentate con cibo normale e quelle alimentate con estratto di P. guajava (1 g/100 mL), Crofelemer (1 g/100 mL) e Loperamide (10 mM). Per l'impostazione dell'esperimento, sono state utilizzate femmine o maschi vergini di 6-7 giorni. Ogni capsula di Petri conteneva sei mosche e sono state effettuate sei repliche. Le mosche sono state allevate per 24 ore e poi ogni gruppo è stato analizzato. Il t-test dello studente è stato utilizzato per confrontare la differenza significativa tra i gruppi di test. I risultati dimostrano che il numero di depositi fecali (Figura 3A), l'area totale dei depositi (Figura 3B) e l'IOD totale (Figura 3C) hanno mostrato valori significativamente più elevati nel gruppo di alimenti normali rispetto al gruppo dell'estratto di P. guajava (1 g/100 mL), sia nelle femmine vergini che nei maschi. Sfortunatamente, la Loperamide non ha mostrato alcun effetto in entrambi i sessi (ma è già stato dimostrato che agisce come agente antispasmodico in D. melanogaster)³⁴ mentre la Crofelemer ha avuto un effetto solo sulle femmine.

Figura 3: Analisi della deformazione ITPi . Il ceppo ITPi è stato analizzato in quattro condizioni: alimentazione con cibo normale, cibo integrato con 1 g/100 mL di estratto di P. guajava , 1 g/100 mL di Crofelemer e 10 mM di Loperamide. I dati sono presentati come media ± SD di ciascuna condizione sia nelle femmine che nei maschi (per sei repliche di due lati di una capsula di Petri). L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il t-test di uno studente confrontando due gruppi. I valori p sono mostrati come segue: *: p < 0,05; **: p < 0,01; : p < 0,001, ****: p < 0,0001. (A) Il numero di depositi fecali del ceppo ITPi è stato confrontato nei moscerini alimentati con cibo integrato con 1 g/100 mL di Crofelemer, 10 mM di Loperamide, 1 g/100 mL di estratto di P. guajava e nei moscerini alimentati con cibo normale. Inoltre, è stata analizzata anche la differenza nel numero di depositi fecali tra femmine vergini e maschi. In entrambi i gruppi, il numero di depositi fecali era significativamente più alto nei moscerini alimentati con cibo normale rispetto a quelli alimentati con 1 g/100 mL di estratto di P. guajava . (B) L'area totale dei depositi fecali del ceppo ITPi è stata confrontata nei moscerini alimentati con cibo normale e nei moscerini alimentati con cibo integrato con 1 g/100 mL di estratto di P. guajava , 1 g/100 mL di Crofelemer e 10 mM di Loperamide. Nei maschi e nelle femmine, l'area totale dei depositi fecali era significativamente più alta nei moscerini alimentati con cibo normale rispetto a quelli alimentati con 1 g/100 mL di estratto di P. guajava . (C) La differenza nell'IOD totale del ceppo ITPi è stata analizzata tra mosche alimentate con cibo normale e mosche alimentate con cibo integrato con 1 g/100 mL di estratto di P. guajava , 1 g/100 mL di Crofelemer e 10 mM di Loperamide. Nei maschi e nelle femmine, l'IOD totale era significativamente più alto nei moscerini alimentati con cibo normale rispetto a quelli alimentati con 1 g/100 mL di estratto di P. guajava . Abbreviazioni: F = Femmina; M = Maschio; Crofe = Crofelemer; Lope = Loperamide; Né cibo = Cibo normale; P. gua ext = Estratto di Psidium guajava . Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per dimostrare che la ridotta escrezione osservata nel gruppo dell'estratto di P. guajava è dovuta all'effetto inibitorio dell'estratto e non a un ridotto consumo di cibo, abbiamo eseguito il metodo³⁵ della stima diretta dell'assunzione e del monitoraggio del consumo di alimenti solidi (DIETS). I risultati hanno mostrato che non c'erano differenze significative nel consumo di cibo tra i gruppi che hanno ricevuto farmaci e quelli senza farmaci, ad eccezione della Loperamide nei maschi, che ha indotto i moscerini a consumare meno cibo del normale (Figura 4).

Figura 4: Saggio di alimentazione. Il test di alimentazione ha misurato il consumo di cibo solido nei moscerini. I moscerini sono stati nutriti con quattro diversi substrati: 1 g/100 mL di estratto di P. guajava , 1 g/100 mL di Crofelemer, 10 mM di Loperamide e cibo normale. Ogni gruppo era composto da 20 mosche con cinque repliche. I dati sono presentati come media ± DS di ciascuna condizione sia nelle femmine che nei maschi. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il t-test di uno studente confrontando due gruppi. I valori p sono mostrati come segue: *: p < 0,05; **: p < 0,01; : p < 0,001, ****: p < 0,0001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

I depositi fecali e i risultati del test di alimentazione hanno mostrato che l'estratto di P. guajava è una pianta medicinale affidabile per il trattamento della diarrea nei moscerini della frutta.

Figura supplementare 1:Finestra di apertura T.U.R.D. Fare clic qui per scaricare il file.

Figura 2 supplementare: Finestra T.UR.D. con impostazioni da regolare. Fare clic qui per scaricare il file.

Figura 3 supplementare: Finestra T.U.R.D. con immagine annotata. Fare clic qui per scaricare il file.

Figura 4 supplementare: Finestra T.U.R.D. che presenta ogni punto rilevato da un'immagine già elaborata. Fare clic qui per scaricare il file.

Figura 5 supplementare: Finestra T.U.R.D. che presenta ogni immagine elaborata. Fare clic qui per scaricare il file.

Figura 6 supplementare: Finestra T.U.R.D. che mostra il processo di esportazione dei dati per ogni gruppo. Fare clic qui per scaricare il file.

File supplementare 1: Guida rapida per l'utilizzo del software T.U.R.D. Fare clic qui per scaricare il file.

Tabella supplementare 1: Esempio dei fogli di calcolo finali pronti per l'analisi. Fare clic qui per scaricare il file.

File di codifica supplementare 1: Domanda per l'unione di fogli di calcolo. Fare clic qui per scaricare il file.

Discussion

D. melanogaster è stato ampiamente accettato come modello per vari processi biologici a causa della somiglianza nei geni tra D. melanogaster e gli esseri umani³⁶. L'uso di D. melanogaster come modello per studiare il tratto intestinale è prevalente e l'applicazione del T.U.R.D. è stata utilizzata per stimare il numero, l'area e la quantità di depositi fecali. Tuttavia, il metodo di rilevamento fenotipico non è stato utilizzato per valutare la diarrea nei moscerini della frutta. Pertanto, questo protocollo introduce un nuovo metodo per valutare approssimativamente la presenza di diarrea rilevando i depositi fecali.

I depositi fecali sono un indicatore essenziale della funzionalità e della salute del tratto intestinale³⁷. In questo contesto, viene proposto un metodo per l'allevamento di D. melanogaster su terreno contenuto in farmaco per studiare vari parametri dei depositi fecali. Monitorando il numero di depositi, è possibile determinare la frequenza della defecazione e valutare se un farmaco ha un impatto sul transito intestinale. L'area totale dei depositi può essere misurata per valutare la concentrazione e la diluizione della materia fecale, che è un fattore importante nel determinare la salute generale del tratto intestinale. Inoltre, la densità ottica totale integrata (IOD) può essere utilizzata per rilevare la quantità totale di materiale fecale presente nei depositi. Questo protocollo fornisce un metodo efficace per lo screening e la valutazione dei farmaci e degli estratti vegetali che influenzano il tratto intestinale. Quando D. melanogaster viene utilizzato come organismo modello, è possibile valutare l'efficacia di potenziali farmaci, che possono aiutare ad accelerare il processo di scoperta di farmaci. Applicando questo metodo agli estratti vegetali, i ricercatori possono aiutare a convalidare il loro uso come agenti antidiarroici.

Ci sono diversi passaggi critici da considerare quando si utilizza questo protocollo per studiare i depositi fecali in D. melanogaster. In primo luogo, è essenziale calcolare la massa necessaria per raggiungere la concentrazione desiderata del farmaco nel mezzo. Inoltre, è importante garantire buone condizioni di preparazione quando si aggiunge il farmaco al terreno, poiché le alte temperature possono degradare il farmaco e influire sulla sua potenza. In secondo luogo, la selezione delle mosche femmine è importante in questo protocollo. È importante utilizzare mosche femmine vergini per evitare le differenze nella produzione fecale tra femmine vergini e accoppiate. Ad esempio, le macchie prodotte dalle femmine vergini sono più circolari rispetto alle femmine accoppiate, e le femmine accoppiate tendono ad espellere più materiale fecale rispetto alle femmine vergini^27,28. Pertanto, si consiglia di raccogliere le mosche prima di 8 ore di eclosion per assicurarsi che tutte le femmine raccolte siano vergini. Inoltre, le mosche testate dovrebbero essere forti e sane, poiché la loro salute può influenzare l'assunzione di cibo e la produzione fecale. Ad esempio, le mosche che hanno una forma anormale delle ali possono avere difficoltà a procurarsi il cibo. Infine, per utilizzare correttamente T.U.R.D., la dimensione del blocco (pixel) e le impostazioni di offset sono fondamentali. A causa della differenza nel contrasto della luce delle immagini, potrebbe essere necessario provare diverse impostazioni per ottenere la migliore identificazione possibile dei depositi fecali.

Sebbene il metodo presentato sia efficace, ci sono diverse limitazioni. Uno è l'accuratezza della concentrazione del farmaco nel mezzo. Poiché il terreno viene riscaldato durante la preparazione, un po' d'acqua può evaporare, il che può influenzare la concentrazione del farmaco. Un'altra limitazione è la scansione delle piastre di Petri. Alcune parti delle piastre di Petri (cioè i bordi) non vengono scansionate e questo potrebbe comportare un errore di calcolo dei depositi fecali totali. Inoltre, le mosche non producono la stessa quantità di depositi fecali sui coperchi superiore e inferiore delle piastre di Petri. Poiché tendono a produrre più depositi sul coperchio inferiore, la deviazione standard dell'analisi tra il coperchio superiore e quello inferiore può essere elevata, il che può influire sull'accuratezza dei risultati.

Utilizzando questo protocollo, i ricercatori possono studiare la diarrea in D. melanogaster. Modificando il mezzo contenente il farmaco, questo metodo può essere utilizzato per lo screening delle piante antidiarroiche, che fornisce un nuovo approccio alla scoperta di farmaci. La medicina tradizionale e i prodotti naturali sono stati utilizzati per secoli per trattare diverse malattie, compresi i disturbi gastrointestinali. Utilizzando questo protocollo per valutare l'efficacia degli estratti vegetali sui depositi fecali, è possibile identificare potenziali nuovi trattamenti per i disturbi del tratto intestinale e fornire un razionale scientifico per il loro utilizzo come agenti antidiarroici. Questo approccio può fornire un prezioso contributo nel campo della scoperta di farmaci e dell'etnofarmacologia.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chimico & Alimento medio
Agar	Sigma Aldrich	A7002	Secchio da 5 Kg
Blu di bromofenolo	Sigma Aldrich	34725-61-6	B5525-25G
Farina di mais	Nature et Cie	*910007	Sacco da 25 Kg
Crofelemer	Napo pharmaceuticals	-	-
Etanolo 96%	-	-	-
Loperamide	Sigma Aldrich	L4762	5 grammi
Moldex	VWR	1.06757.5000	Sacchetto da 5 Kg
Acido propionico	Dutscher	409553-CER	Bottiglia da 1 litro
Zucchero	Pomona EpiSaveurs	52705	Sacchetto da 1 Kg
Lievito	Dutscher	789195	Sacco da 10 Kg
Materiali
Becher	DWK LIFE SCIENCE-250		mL
Provetta per centrifugazione	Eppendorf	30119401	Provette Eppendorf    5,0 mL
CO2 serbatoio	-	--
Pallone Erlen Meyer	-		500 mL (per l'estrazione)
Carta da filtro	grado Whatman-3		mm chr.
Flowbuddy socle	Genesis	-	-
Flugs Narrow Plastic fiale	Genesis	49-102-Flystuff
Pistola ad aria compressa	Genesis	-	-
Flystuff Ultimate Flypad	Genesis	-	-
Flystuff Pedale	Genesis	-	-
Pinze	Dumostar	11295-51	-
Cilindro graduato	-	-	Spatola Inox da 100 ml-
		-
Micropipetta	Eppendorf	4924000088	Eppendorf Reference  2
puntali per micropipette	Eppendorf	30000919	epT.I.P.S.
Standard Narrow Drosophila fiale	Genesis	32-120-Pennello
	-	--
Piastra di Petri	Greiner	628162	Dimensioni: 60 x 15 mm
Pallone a fondo tondo	-		500 ml (per evaporazione)
Termometro	Avantor	620-0916
Frusta	-	-	-
Attrezzature
Chiller	HUBER	Minichiller-Bagno
di riscaldamento	BÜ CHI	B-490-Piastra
riscaldante	BIOBLOCK SCIENTIFIC-Piastra		riscaldante con agitatore magnetico
Incubatore
Evaporatore rotante	BÜ CHI	R-200-Scanner
	Epson	V850	pro-Shaker
	Edmund Bü hle	KS	10-Stereomicroscopio
binoculare	Zeiss	Stemi 305-Pompa
a vuoto	VACUUBRAND	PC500
series-Vortex mixer	Sigma Aldrich	CLS6776-1EA	Corning  LSE  miscelatori a vortice
Bilancia	OHAUS Scout	SKX622	-