Effiziente Generierung von murinen chimären Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen
Summary
Dieses Protokoll rationalisiert die retrovirale Vektorproduktion und die murine T-Zelltransduktion und erleichtert die effiziente Generierung von CAR-T-Zellen der Maus.
Abstract
Technisch hergestellte Zelltherapien, die chimäre Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen verwenden, haben eine bemerkenswerte Wirksamkeit bei Personen mit hämatologischen Malignomen erreicht und befinden sich derzeit in der Entwicklung für die Behandlung verschiedener solider Tumoren. Bisher erfolgte die vorläufige Evaluierung neuartiger CAR-T-Zellprodukte überwiegend in Xenograft-Tumormodellen mit immundefizienten Mäusen. Dieser Ansatz wurde gewählt, um die erfolgreiche Transplantation von humanen CAR-T-Zellen in der experimentellen Umgebung zu erleichtern. Syngene Mausmodelle, in denen Tumore und CAR-T-Zellen vom selben Mausstamm abstammen, erlauben jedoch die Evaluierung neuer CAR-Technologien im Kontext eines funktionierenden Immunsystems und einer umfassenden Tumormikroumgebung (TME). Das hier beschriebene Protokoll zielt darauf ab, den Prozess der Generierung von CAR-T-Zellen in der Maus zu rationalisieren, indem standardisierte Methoden für die retrovirale Transduktion und die ex vivo T-Zellkultur vorgestellt werden. Die in diesem Protokoll beschriebenen Methoden können auf andere CAR-Konstrukte als die in dieser Studie verwendeten angewendet werden, um eine routinemäßige Evaluierung neuer CAR-Technologien in immunkompetenten Systemen zu ermöglichen.
Introduction
Adoptive T-Zell-Therapien, die chimäre Antigenrezeptoren (CARs) exprimieren, haben das Gebiet der Krebsimmuntherapie revolutioniert, indem sie die Kraft des adaptiven Immunsystems nutzen, um antigenpositive Krebszellen spezifisch anzuvisieren und zu eliminieren1. Während der Erfolg von CAR-T-Zelltherapien, die auf maligne B-Zell-Erkrankungen abzielen, klinisch validiert wurde, sind präklinische Studien, die in Tiermodellen durchgeführt wurden, für die Entwicklung neuer CARs, die auf solide Tumore abzielen, nach wie vor von entscheidender Bedeutung. Bisher konnte jedoch nur eine begrenzte klinische Wirksamkeit bei soliden Tumorindikationen nachgewiesen werden, und es wird immer deutlicher, dass einzelne präklinische Modelle die Pharmakodynamik und klinische Wirksamkeit eines lebenden Arzneimittels nicht genau vorhersagen 2,3. Daher haben die Forscher begonnen, die präklinische Studie mit CAR-T-Zellprodukten zu erweitern, um parallele Bewertungen in Xenotransplantat- und syngenen Modellen von menschlichen bzw. murinen Krebserkrankungen einzubeziehen.
Im Gegensatz zu Xenograft-Modellen, bei denen menschliche Tumore und T-Zellen in immundefiziente Mäuse transplantiert werden, ermöglichen syngene Modelle die Untersuchung von CAR-T-Zellantworten im Kontext eines funktionierenden Immunsystems. Insbesondere bieten immunkompetente Mäuse mit syngenen Tumoren ein System zur Untersuchung der Interaktion zwischen adoptiv übertragenen T-Zellen und kontextspezifischen Milieus – einschließlich tumorassoziierter Makrophagen (TAMs) und regulatorischer T-Zellen (Tregs), von denen bekannt ist, dass sie die T-Zell-Funktion in der Tumormikroumgebung (TME) unterdrücken4,5,6. Darüber hinaus bieten syngene Modelle eine zusätzliche Plattform zur Bewertung der On-Target- und Off-Tumor-Toxizität und der Interaktion von CAR-T-Zellen mit Wirtsfaktoren, die zu zusätzlichen Toxizitäten führen können, einschließlich des Zytokinfreisetzungssyndroms7.
Trotz dieser Vorteile ist die Anzahl der syngenen CAR-T-Zellstudien nach wie vor begrenzt. Insbesondere erfordern syngene Modelle ein autologes Engineering von CAR-T-Zellen aus demselben Mausstamm und stellen daher eine zusätzliche Herausforderung dar, da es keine Methodik für eine effiziente murine T-Zell-Transduktion und ex vivo Expansion gibt 2,8. Dieses Protokoll beschreibt die Methoden, um eine stabile CAR-Expression durch die Produktion retroviraler Vektoren und eine optimierte T-Zell-Transduktion zu erreichen. Ein Schema des gesamten Prozesses ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Verwendung dieses Ansatzes demonstriert eine effiziente retrovirale Transduktion von murinen CAR-T-Zellen und das Erreichen einer hohen CAR-Expression ohne die Notwendigkeit einer Viruskonzentration durch Ultrazentrifugation. Neben der Co-Expression weiterer Transgene werden auch Strategien zur Veränderung der Antigenspezifität des CAR-Konstrukts diskutiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt die Schritte und Reagenzien, die für die retrovirale Transduktion von murinen T-Zellen zur Generierung von CAR-T-Zellen für In-vivo-Studien erforderlich sind. Durch die Optimierung der retroviralen Transduktionsbedingungen wird eine robuste CAR-Expression erreicht, ohne dass eine Viruskonzentration durch Ultrazentrifugation oder zusätzliche Reagenzien erforderlich ist. Es gibt jedoch mehrere Modifikationen, die auf diese Methodik angewendet werden können.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken L. Brockmann für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch NIH 1R01EB030352 und UL1 TR001873 unterstützt.
Materials
| 0.45 μm filters | MilliporeSigma | SLHVR33RS | |
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | 14-955-450 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-135 | |
| 10 mL syringe | BD | 14-823-16E | |
| 100 μm strainer | Corning | 07-201-432 | |
| 15 cm TC treated cell culture dishes | ThermoFisher Scientific | 130183 | |
| 15 mL conical tubes | Falcon | 14-959-70C | |
| 40 μm strainer | Corning | 07-201-430 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-959-49A | |
| 70 μm strainer | Corning | 07-201-431 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | ||
| BALB/C, 6-8 week old | Jackson Laboratory | 651 | |
| B-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| Bovine Serum Albumin | GOLDBIO | A-420-500 | |
| DMEM Medium | Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium | Gibco | 14-190-250 | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12-321-D | |
| EasySep Magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse T cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19851 | |
| FACS buffer | BD | BDB554657 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | MT35011CV | |
| GlutaMAX | Gibco | 35-050-061 | |
| G-Rex6 | Wilson Wolf | 80240M | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15-630-080 | |
| Human recombinant IL-15 | Miltenyi Biotec | 130-095-765 | |
| Human recombinant IL-2 | Miltenyi Biotec | 130-097-748 | |
| Human recombinant IL-7 | Miltenyi Biotec | 130-095-363 | |
| Lipofectamine 3000 | Invitrogen | L3000008 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140-050 | |
| Mouse Anti-CD3 BV421 | Biolegend | 100228 | |
| Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads | Gibco | 11-453-D | |
| Mouse Anti-CD4 BV605 | BD | 563151 | |
| Mouse Anti-CD44 APC | Biolegend | 103011 | |
| Mouse Anti-CD62L PE-Cy7 | Tonbo | SKU 60-0621-U025 | |
| Mouse Anti-CD8 APC-Cy7 | Tonbo | SKU 25-0081-U025 | |
| Nikon Ti2 with Prime 95B camera | Nikon | ||
| Non-treated 24 well plates | CytoOne | CC7672-7524 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31-985-062 | |
| pCL-Eco | Addgene | #12371 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Gibco | 15-070-063 | |
| Phoenix Eco cells | ATCC | CRL-3214 | |
| pMDG.2 | Addgene | #12259 | |
| pMSCV_PGK_GFP28z | N/A | Produced by R.LV. | |
| Purified sfGFP | N/A | Produced by R.LV. | |
| RetroNectin ('transduction reagent') | Takara Bio | T100B | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875 | |
| Serological pipette 10 mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Serological pipette 25 mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
| Serological pipette 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11-360-070 | |
| TC-treated 24 well plates | Corning | 08-772-1 | |
| Trypan blue | Gibco | 15-250-061 |
Riferimenti
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