التوليد الفعال لمستقبلات مستضد الفئران الخيمري (CAR) - الخلايا التائية
Summary
يبسط هذا البروتوكول إنتاج النواقل الفيروسية القهقرية ونقل الخلايا التائية للفأر ، مما يسهل التوليد الفعال للخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية للفئران.
Abstract
حققت العلاجات الخلوية المهندسة باستخدام مستقبلات المستضد الخيمري (CAR) -T فعالية ملحوظة في الأفراد المصابين بالأورام الخبيثة الدموية وتخضع حاليا للتطوير لعلاج الأورام الصلبة المتنوعة. حتى الآن ، تم إجراء التقييم الأولي لمنتجات الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية الجديدة في الغالب في نماذج ورم xenograft باستخدام الفئران التي تعاني من نقص المناعة. تم اختيار هذا النهج لتسهيل التطعيمات الناجحة للخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية البشرية في البيئة التجريبية. ومع ذلك ، فإن نماذج الفئران التخليقية ، التي تستمد فيها الأورام والخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية من نفس سلالة الفأر ، تسمح بتقييم تقنيات CAR الجديدة في سياق نظام المناعة الوظيفي والبيئة المكروية الشاملة للورم (TME). يهدف البروتوكول الموصوف هنا إلى تبسيط عملية توليد الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية في الفأر من خلال تقديم طرق موحدة لنقل الفيروسات القهقرية وزراعة الخلايا التائية خارج الجسم الحي . يمكن تطبيق الطرق الموضحة في هذا البروتوكول على تركيبات CAR الأخرى بخلاف تلك المستخدمة في هذه الدراسة لتمكين التقييم الروتيني لتقنيات CAR الجديدة في الأنظمة ذات الكفاءة المناعية.
Introduction
أحدثت علاجات الخلايا التائية بالتبني التي تعبر عن مستقبلات المستضدات الخيمرية (CARs) ثورة في مجال العلاج المناعي للسرطان من خلال تسخير قوة جهاز المناعة التكيفي لاستهداف الخلايا السرطانية الإيجابية للمستضد والقضاء عليها على وجه التحديد1. في حين تم التحقق سريريا من صحة نجاح علاجات الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية التي تستهدف الأورام الخبيثة في الخلايا البائية ، تظل الدراسات قبل السريرية التي أجريت على النماذج الحيوانية حيوية لتطوير مستقبلات المستضدات الوهمية الجديدة التي تستهدف الأورام الصلبة. ومع ذلك ، فقد تم إثبات فعالية سريرية محدودة في مؤشرات الورم الصلب حتى الآن ، وأصبح من الواضح بشكل متزايد أن النماذج الفردية قبل السريرية لا تتنبأ بدقة بالديناميكا الدوائية والفعالية السريرية للدواءالحي 2,3. لذلك ، بدأ الباحثون في توسيع الدراسة قبل السريرية لمنتجات الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية لتشمل تقييمات موازية في النماذج الغريبة والنماذج الجينية لسرطانات الإنسان والفئران ، على التوالي.
على عكس نماذج الطعم الأجنبي ، حيث يتم غرس الأورام البشرية والخلايا التائية في الفئران التي تعاني من نقص المناعة ، فإن النماذج الجينية تمكن من فحص استجابات الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية في سياق نظام المناعة الوظيفي. على وجه التحديد ، توفر الفئران ذات الكفاءة المناعية التي تحمل أوراما متزامنة نظاما لدراسة التفاعل بين الخلايا التائية المنقولة بالتبني والأوساط الخاصة بالسياق – بما في ذلك الضامة المرتبطة بالورم (TAMs) والخلايا التائية التنظيمية (Tregs) المعروفة بقمع وظيفة الخلايا التائية في البيئة المكروية للورم (TME)4،5،6. علاوة على ذلك ، توفر النماذج الجينية منصة إضافية لتقييم السمية المستهدفة خارج الورم ، وتفاعل الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية مع العوامل المضيفة التي قد تؤدي إلى سمية إضافية ، بما في ذلك متلازمة إطلاق السيتوكين7.
على الرغم من هذه المزايا ، لا يزال عدد دراسات الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية الاصطناعية محدودا. والجدير بالذكر أن النماذج التخليقية تتطلب هندسة ذاتية لخلايا CAR-T من نفس سلالة الفأر ، وبالتالي تمثل تحديا إضافيا بسبب عدم وجود منهجية لنقل الخلايا التائية الفعالة للفأر والتوسع خارج الجسم الحي 2,8. يحدد هذا البروتوكول طرق تحقيق تعبير مستقر عن CAR من خلال إنتاج ناقلات الفيروسات القهقرية ونقل الخلايا التائية الأمثل. يظهر رسم تخطيطي للعملية بأكملها في الشكل 1. يوضح استخدام هذا النهج النقل الفعال للفيروسات القهقرية للخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية وتحقيق تعبير عالي عن CAR دون الحاجة إلى تركيز فيروسي من خلال الطرد المركزي الفائق. تتم مناقشة استراتيجيات تغيير خصوصية المستضد لبناء CAR بالإضافة إلى التعبير المشترك عن جينات التحوير الإضافية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول الخطوات والكواشف اللازمة لنقل الفيروسات القهقرية للخلايا التائية الفئرانية لتوليد خلايا CAR-T للدراسات في الجسم الحي . إن تحسين ظروف نقل الفيروسات القهقرية يحقق تعبيرا قويا عن CAR دون الحاجة إلى تركيز فيروسي من خلال الطرد المركزي الفائق أو الكواشف الإضافية. ومع ذلك ، …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر L. Brockmann على المراجعة النقدية للمخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل NIH 1R01EB030352 و UL1 TR001873.
Materials
| 0.45 μm filters | MilliporeSigma | SLHVR33RS | |
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | 14-955-450 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-135 | |
| 10 mL syringe | BD | 14-823-16E | |
| 100 μm strainer | Corning | 07-201-432 | |
| 15 cm TC treated cell culture dishes | ThermoFisher Scientific | 130183 | |
| 15 mL conical tubes | Falcon | 14-959-70C | |
| 40 μm strainer | Corning | 07-201-430 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-959-49A | |
| 70 μm strainer | Corning | 07-201-431 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | ||
| BALB/C, 6-8 week old | Jackson Laboratory | 651 | |
| B-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| Bovine Serum Albumin | GOLDBIO | A-420-500 | |
| DMEM Medium | Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium | Gibco | 14-190-250 | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12-321-D | |
| EasySep Magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse T cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19851 | |
| FACS buffer | BD | BDB554657 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | MT35011CV | |
| GlutaMAX | Gibco | 35-050-061 | |
| G-Rex6 | Wilson Wolf | 80240M | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15-630-080 | |
| Human recombinant IL-15 | Miltenyi Biotec | 130-095-765 | |
| Human recombinant IL-2 | Miltenyi Biotec | 130-097-748 | |
| Human recombinant IL-7 | Miltenyi Biotec | 130-095-363 | |
| Lipofectamine 3000 | Invitrogen | L3000008 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140-050 | |
| Mouse Anti-CD3 BV421 | Biolegend | 100228 | |
| Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads | Gibco | 11-453-D | |
| Mouse Anti-CD4 BV605 | BD | 563151 | |
| Mouse Anti-CD44 APC | Biolegend | 103011 | |
| Mouse Anti-CD62L PE-Cy7 | Tonbo | SKU 60-0621-U025 | |
| Mouse Anti-CD8 APC-Cy7 | Tonbo | SKU 25-0081-U025 | |
| Nikon Ti2 with Prime 95B camera | Nikon | ||
| Non-treated 24 well plates | CytoOne | CC7672-7524 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31-985-062 | |
| pCL-Eco | Addgene | #12371 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Gibco | 15-070-063 | |
| Phoenix Eco cells | ATCC | CRL-3214 | |
| pMDG.2 | Addgene | #12259 | |
| pMSCV_PGK_GFP28z | N/A | Produced by R.LV. | |
| Purified sfGFP | N/A | Produced by R.LV. | |
| RetroNectin ('transduction reagent') | Takara Bio | T100B | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875 | |
| Serological pipette 10 mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Serological pipette 25 mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
| Serological pipette 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11-360-070 | |
| TC-treated 24 well plates | Corning | 08-772-1 | |
| Trypan blue | Gibco | 15-250-061 |
Riferimenti
- June, C. H., Sadelain, M. Chimeric antigen receptor therapy. N Engl J Med. 379 (1), 64-73 (2018).
- Duncan, B. B., Dunbar, C. E., Ishii, K. Applying a clinical lens to animal models of car-t cell therapies. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 17-31 (2022).
- Hou, A. J., Chen, L. C., Chen, Y. Y. Navigating CAR-T cells through the solid-tumour microenvironment. Nat Rev Drug Discov. 20 (7), 531-550 (2021).
- Campesato, L. F., et al. Blockade of the ahr restricts a treg-macrophage suppressive axis induced by l-kynurenine. Nat Commun. 11 (1), 4011 (2020).
- Kaneda, M. M., et al. Pi3kgamma is a molecular switch that controls immune suppression. Nature. 539 (7629), 437-442 (2016).
- Hyrenius-Wittsten, A., Roybal, K. T. Paving new roads for cars. Trends Cancer. 5 (10), 583-592 (2019).
- Giavridis, T., et al. CAR T cell-induced cytokine release syndrome is mediated by macrophages and abated by il-1 blockade. Nat Med. 24 (6), 731-738 (2018).
- Lanitis, E., et al. Optimized gene engineering of murine CAR-T cells reveals the beneficial effects of il-15 coexpression. J Exp Med. 218 (2), e20192203 (2021).
- Lambeth, C. R., White, L. J., Johnston, R. E., De Silva, A. M. Flow cytometry-based assay for titrating dengue virus. J Clin Microbiol. 43 (7), 3267-3272 (2005).
- Agarwal, S., Wellhausen, N., Levine, B. L., June, C. H. Production of human crispr-engineered CAR-T cells. J Vis Exp. 169, e62299 (2021).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Sterile Tissue Harvest. , (2023).
- Giordano-Attianese, G., et al. A computationally designed chimeric antigen receptor provides a small-molecule safety switch for t-cell therapy. Nat Biotechnol. 38 (4), 426-432 (2020).
- Kuhn, N. F., et al. Cd40 ligand-modified chimeric antigen receptor T cells enhance antitumor function by eliciting an endogenous antitumor response. Cancer Cell. 35 (3), 473-488.e6 (2019).
- Jin, C., Ma, J., Ramachandran, M., Yu, D., Essand, M. CAR T cells expressing a bacterial virulence factor trigger potent bystander antitumour responses in solid cancers. Nat Biomed Eng. 6 (7), 830-841 (2022).
- Kurachi, M., et al. Optimized retroviral transduction of mouse T cells for in vivo assessment of gene function. Nat Protoc. 12 (9), 1980-1998 (2017).
- Jafarzadeh, L., Masoumi, E., Fallah-Mehrjardi, K., Mirzaei, H. R., Hadjati, J. Prolonged persistence of chimeric antigen receptor (CAR) T cell in adoptive cancer immunotherapy: Challenges and ways forward. Front Immunol. 11, 702 (2020).
- Elkassar, N., Gress, R. E. An overview of IL-7 biology and its use in immunotherapy. J Immunotoxicol. 7 (1), 1-7 (2010).
- Osinalde, N., et al. Simultaneous dissection and comparison of IL-2 and IL-15 signaling pathways by global quantitative phosphoproteomics. Proteomics. 15 (2-3), 520-531 (2015).
- Eremenko, E., et al. An optimized protocol for the retroviral transduction of mouse CD4 T cells. STAR Protoc. 2 (3), 100719 (2021).
- Lewis, M. D., et al. A reproducible method for the expansion of mouse CD8+ T lymphocytes. J Immunol Methods. 417, 134-138 (2015).
