Effektiv generering af murine kimære antigenreceptorceller (CAR)-T-celler
Summary
Denne protokol strømliner retroviral vektorproduktion og murine T-celletransduktion, hvilket letter effektiv generering af muse-CAR-T-celler.
Abstract
Konstruerede celleterapier ved hjælp af kimære antigenreceptorceller (CAR)-T-celler har opnået bemærkelsesværdig effektivitet hos personer med hæmatologiske maligniteter og er i øjeblikket under udvikling til behandling af forskellige faste tumorer. Indtil videre har den foreløbige evaluering af nye CAR-T-celleprodukter overvejende fundet sted i xenografttumormodeller ved hjælp af immundefekte mus. Denne tilgang er valgt for at lette en vellykket indgravering af humane CAR-T-celler i forsøgsmiljøet. Imidlertid tillader syngeneiske musemodeller, hvor tumorer og CAR-T-celler stammer fra den samme musestamme, evaluering af nye CAR-teknologier i forbindelse med et funktionelt immunsystem og omfattende tumormikromiljø (TME). Protokollen beskrevet her sigter mod at strømline processen med muse-CAR-T-cellegenerering ved at præsentere standardiserede metoder til retroviral transduktion og ex vivo T-cellekultur. De metoder, der er beskrevet i denne protokol, kan anvendes på andre CAR-konstruktioner ud over dem, der anvendes i denne undersøgelse, for at muliggøre rutinemæssig evaluering af nye CAR-teknologier i immunkompetente systemer.
Introduction
Adoptive T-celleterapier, der udtrykker kimære antigenreceptorer (CAR’er), har revolutioneret kræftimmunterapiområdet ved at udnytte kraften i det adaptive immunsystem til specifikt at målrette og eliminere antigenpositive kræftceller1. Mens succesen med CAR-T-celleterapier rettet mod B-cellemaligniteter er blevet klinisk valideret, er prækliniske undersøgelser udført i dyremodeller fortsat afgørende for udviklingen af nye CAR’er rettet mod solide tumorer. Imidlertid er begrænset klinisk effekt hidtil blevet påvist i solide tumorindikationer, og det bliver stadig mere tydeligt, at individuelle prækliniske modeller ikke nøjagtigt forudsiger farmakodynamikken og den kliniske effekt af et levende lægemiddel 2,3. Derfor er forskere begyndt at udvide den prækliniske undersøgelse af CAR-T-celleprodukter til at omfatte parallelle vurderinger i xenograft og syngeneic modeller af henholdsvis human og murine kræft.
I modsætning til xenograftmodeller, hvor humane tumorer og T-celler er indpodet i immundefekte mus, muliggør syngeneiske modeller undersøgelse af CAR-T-celleresponser i forbindelse med et funktionelt immunsystem. Specifikt giver immunkompetente mus med syngeneiske tumorer et system til at studere interaktionen mellem adoptivt overførte T-celler og kontekstspecifikke miljøer – herunder tumorassocierede makrofager (TAM’er) og regulatoriske T-celler (Tregs), der vides at undertrykke T-cellefunktion i tumormikromiljøet (TME)4,5,6. Desuden tilbyder syngeneiske modeller en yderligere platform til vurdering af on-target, off-tumor toksicitet og CAR-T-celleinteraktion med værtsfaktorer, der kan føre til yderligere toksiciteter, herunder cytokinfrigivelsessyndrom7.
På trods af disse fordele er antallet af syngeneiske CAR-T-celleundersøgelser fortsat begrænset. Især kræver syngeneiske modeller autolog konstruktion af CAR-T-celler fra den samme musestamme og udgør derfor en yderligere udfordring på grund af manglen på metode til effektiv murine T-celletransduktion og ex vivo-ekspansion 2,8. Denne protokol skitserer metoderne til at opnå stabil CAR-ekspression gennem produktion af retrovirale vektorer og optimeret T-celletransduktion. Et skema over hele processen er vist i figur 1. Anvendelsen af denne fremgangsmåde demonstrerer effektiv retroviral transduktion af murin CAR-T-celler og opnåelse af høj CAR-ekspression uden behov for viral koncentration gennem ultracentrifugering. Strategier til ændring af antigenspecificiteten af CAR-konstruktionen diskuteres ud over co-ekspressionen af yderligere transgener.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskriver de trin og reagenser, der er nødvendige for retroviral transduktion af murine T-celler til generering af CAR-T-celler til in vivo-undersøgelser . Optimering af retrovirale transduktionsbetingelser opnår robust CAR-ekspression uden behov for viral koncentration gennem ultracentrifugering eller yderligere reagenser. Der er dog flere ændringer, der kan anvendes på denne metode.
Mens denne protokol beskriver eksempelgenerering af en GFP-specifik CAR, kan diss…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker L. Brockmann for den kritiske gennemgang af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af NIH 1R01EB030352 og UL1 TR001873.
Materials
| 0.45 μm filters | MilliporeSigma | SLHVR33RS | |
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | 14-955-450 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-135 | |
| 10 mL syringe | BD | 14-823-16E | |
| 100 μm strainer | Corning | 07-201-432 | |
| 15 cm TC treated cell culture dishes | ThermoFisher Scientific | 130183 | |
| 15 mL conical tubes | Falcon | 14-959-70C | |
| 40 μm strainer | Corning | 07-201-430 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-959-49A | |
| 70 μm strainer | Corning | 07-201-431 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | ||
| BALB/C, 6-8 week old | Jackson Laboratory | 651 | |
| B-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| Bovine Serum Albumin | GOLDBIO | A-420-500 | |
| DMEM Medium | Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium | Gibco | 14-190-250 | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12-321-D | |
| EasySep Magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse T cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19851 | |
| FACS buffer | BD | BDB554657 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | MT35011CV | |
| GlutaMAX | Gibco | 35-050-061 | |
| G-Rex6 | Wilson Wolf | 80240M | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15-630-080 | |
| Human recombinant IL-15 | Miltenyi Biotec | 130-095-765 | |
| Human recombinant IL-2 | Miltenyi Biotec | 130-097-748 | |
| Human recombinant IL-7 | Miltenyi Biotec | 130-095-363 | |
| Lipofectamine 3000 | Invitrogen | L3000008 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140-050 | |
| Mouse Anti-CD3 BV421 | Biolegend | 100228 | |
| Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads | Gibco | 11-453-D | |
| Mouse Anti-CD4 BV605 | BD | 563151 | |
| Mouse Anti-CD44 APC | Biolegend | 103011 | |
| Mouse Anti-CD62L PE-Cy7 | Tonbo | SKU 60-0621-U025 | |
| Mouse Anti-CD8 APC-Cy7 | Tonbo | SKU 25-0081-U025 | |
| Nikon Ti2 with Prime 95B camera | Nikon | ||
| Non-treated 24 well plates | CytoOne | CC7672-7524 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31-985-062 | |
| pCL-Eco | Addgene | #12371 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Gibco | 15-070-063 | |
| Phoenix Eco cells | ATCC | CRL-3214 | |
| pMDG.2 | Addgene | #12259 | |
| pMSCV_PGK_GFP28z | N/A | Produced by R.LV. | |
| Purified sfGFP | N/A | Produced by R.LV. | |
| RetroNectin ('transduction reagent') | Takara Bio | T100B | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875 | |
| Serological pipette 10 mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Serological pipette 25 mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
| Serological pipette 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11-360-070 | |
| TC-treated 24 well plates | Corning | 08-772-1 | |
| Trypan blue | Gibco | 15-250-061 |
Riferimenti
- June, C. H., Sadelain, M. Chimeric antigen receptor therapy. N Engl J Med. 379 (1), 64-73 (2018).
- Duncan, B. B., Dunbar, C. E., Ishii, K. Applying a clinical lens to animal models of car-t cell therapies. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 17-31 (2022).
- Hou, A. J., Chen, L. C., Chen, Y. Y. Navigating CAR-T cells through the solid-tumour microenvironment. Nat Rev Drug Discov. 20 (7), 531-550 (2021).
- Campesato, L. F., et al. Blockade of the ahr restricts a treg-macrophage suppressive axis induced by l-kynurenine. Nat Commun. 11 (1), 4011 (2020).
- Kaneda, M. M., et al. Pi3kgamma is a molecular switch that controls immune suppression. Nature. 539 (7629), 437-442 (2016).
- Hyrenius-Wittsten, A., Roybal, K. T. Paving new roads for cars. Trends Cancer. 5 (10), 583-592 (2019).
- Giavridis, T., et al. CAR T cell-induced cytokine release syndrome is mediated by macrophages and abated by il-1 blockade. Nat Med. 24 (6), 731-738 (2018).
- Lanitis, E., et al. Optimized gene engineering of murine CAR-T cells reveals the beneficial effects of il-15 coexpression. J Exp Med. 218 (2), e20192203 (2021).
- Lambeth, C. R., White, L. J., Johnston, R. E., De Silva, A. M. Flow cytometry-based assay for titrating dengue virus. J Clin Microbiol. 43 (7), 3267-3272 (2005).
- Agarwal, S., Wellhausen, N., Levine, B. L., June, C. H. Production of human crispr-engineered CAR-T cells. J Vis Exp. 169, e62299 (2021).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Sterile Tissue Harvest. , (2023).
- Giordano-Attianese, G., et al. A computationally designed chimeric antigen receptor provides a small-molecule safety switch for t-cell therapy. Nat Biotechnol. 38 (4), 426-432 (2020).
- Kuhn, N. F., et al. Cd40 ligand-modified chimeric antigen receptor T cells enhance antitumor function by eliciting an endogenous antitumor response. Cancer Cell. 35 (3), 473-488.e6 (2019).
- Jin, C., Ma, J., Ramachandran, M., Yu, D., Essand, M. CAR T cells expressing a bacterial virulence factor trigger potent bystander antitumour responses in solid cancers. Nat Biomed Eng. 6 (7), 830-841 (2022).
- Kurachi, M., et al. Optimized retroviral transduction of mouse T cells for in vivo assessment of gene function. Nat Protoc. 12 (9), 1980-1998 (2017).
- Jafarzadeh, L., Masoumi, E., Fallah-Mehrjardi, K., Mirzaei, H. R., Hadjati, J. Prolonged persistence of chimeric antigen receptor (CAR) T cell in adoptive cancer immunotherapy: Challenges and ways forward. Front Immunol. 11, 702 (2020).
- Elkassar, N., Gress, R. E. An overview of IL-7 biology and its use in immunotherapy. J Immunotoxicol. 7 (1), 1-7 (2010).
- Osinalde, N., et al. Simultaneous dissection and comparison of IL-2 and IL-15 signaling pathways by global quantitative phosphoproteomics. Proteomics. 15 (2-3), 520-531 (2015).
- Eremenko, E., et al. An optimized protocol for the retroviral transduction of mouse CD4 T cells. STAR Protoc. 2 (3), 100719 (2021).
- Lewis, M. D., et al. A reproducible method for the expansion of mouse CD8+ T lymphocytes. J Immunol Methods. 417, 134-138 (2015).
