Questo protocollo semplifica la produzione di vettori retrovirali e la trasduzione delle cellule T murine, facilitando la generazione efficiente di cellule CAR-T di topo.
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Articolo metodologico
Generazione efficiente di cellule T del recettore chimerico murino dell'antigene (CAR)-T
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le terapie cellulari ingegnerizzate che utilizzano cellule T del recettore chimerico dell'antigene (CAR)-T hanno raggiunto una notevole efficacia in individui con neoplasie ematologiche e sono attualmente in fase di sviluppo per il trattamento di diversi tumori solidi. Finora, la valutazione preliminare di nuovi prodotti a base di cellule CAR-T ha avuto luogo prevalentemente in modelli tumorali xenotrapiantati utilizzando topi immunodeficienti. Questo approccio è stato scelto per facilitare il successo dell'attecchimento delle cellule CAR-T umane in ambito sperimentale. Tuttavia, i modelli murini singetici, in cui i tumori e le cellule CAR-T derivano dallo stesso ceppo murino, consentono di valutare le nuove tecnologie CAR nel contesto di un sistema immunitario funzionale e di un microambiente tumorale completo (TME). Il protocollo qui descritto mira a semplificare il processo di generazione di cellule CAR-T di topo presentando metodi standardizzati per la trasduzione retrovirale e la coltura di cellule T ex vivo . I metodi descritti in questo protocollo possono essere applicati ad altri costrutti CAR oltre a quelli utilizzati in questo studio per consentire la valutazione di routine di nuove tecnologie CAR in sistemi immuno-competenti.
Introduzione
Le terapie adottive con cellule T che esprimono recettori chimerici dell'antigene (CAR) hanno rivoluzionato il campo dell'immunoterapia del cancro sfruttando la potenza del sistema immunitario adattativo per colpire ed eliminare in modo specifico le cellule tumorali positive all'antigene1. Mentre il successo delle terapie cellulari CAR-T mirate alle neoplasie a cellule B è stato clinicamente convalidato, gli studi preclinici eseguiti su modelli animali rimangono vitali per lo sviluppo di nuove CAR mirate ai tumori solidi. Tuttavia, finora è stata dimostrata un'efficacia clinica limitata nelle indicazioni per i tumori solid....
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Protocollo
Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite con l'approvazione dell'Institutional Animal Care and Use Committee (Columbia University, protocolli AC-AABQ5551 e AC-AAAZ4470) utilizzando topi femmine BALB/c o CF57BL/6 di 6-8 settimane di peso compreso tra 20 e 25 g. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali). Questo protocollo è strutturato intorno ai "giorni post-attivazione" delle cellule T murine e la produzione virale inizia il giorno -2. Il retrovirus può essere conservato a -80 °C dopo la produzione iniziale e, per l'uso futuro di questo protocollo, si può iniziare con la fase 2, l'isolamento e l'....
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Risultati
Il protocollo qui descritto mira a standardizzare il processo di trasduzione delle cellule T murine per la generazione di cellule CAR-T di topo. La Figura 1 fornisce una descrizione dettagliata dei passaggi necessari. Il processo inizia con la produzione di vettori retrovirali attraverso la co-trasfezione di componenti virali in cellule Phoenix Eco. La Figura 2 fornisce un'immagine della densità ottimale delle celle Phoenix Eco il giorno della trasfezio.......
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Discussione
Questo protocollo descrive le fasi e i reagenti necessari per la trasduzione retrovirale delle cellule T murine per generare cellule CAR-T per studi in vivo . L'ottimizzazione delle condizioni di trasduzione retrovirale consente di ottenere una robusta espressione di CAR senza la necessità di concentrazione virale attraverso l'ultracentrifugazione o reagenti aggiuntivi. Tuttavia, ci sono diverse modifiche che possono essere applicate a questa metodologia.
Mentre questo protocollo desc.......
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Dichiarazioni
Non sono stati dichiarati conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Si ringrazia L. Brockmann per la revisione critica del manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da NIH 1R01EB030352 e UL1 TR001873.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,45 μ m filtri | MilliporeSigma | SLHVR33RS | |
| siringa da 1 mL | Fisher Scientific | 14-955-450 | |
| Provette per microcentrifuga da 1,5 mL | Fisher Scientific | 05-408-135 | |
| Siringa da 10 mL | BD | 14-823-16E | |
| 100 μ m colino | Corning | 07-201-432 | |
| piastre per colture cellulari trattate TC da 15 cm | ThermoFisher Scientific | ||
| provette coniche da 15 mL | Falcon | 14-959-70C | |
| 40 μ m filtro | Corning | 07-201-430 | |
| Provette coniche da 50 mL | Falcon | 14-959-49A | |
| 70 μ m filtro | Corning | 07-201-431 | |
| Citometro a flusso Attune NxT | ThermoFisher Scientific | ||
| BALB/C, 6-8 settimane | Jackson Laboratory | 651 | |
| B-Mercaptoetanolo | Gibco | 21985023 | |
| Albumina Sierica Bovina | GOLDBIO | A-420-500 | |
| DMEM Medium | Gibco | 11965092 | |
| soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (PBS), senza calcio e magnesio | Magnete Gibco | 14-190-250 | |
| DynaMag-2 | Magnete Invitrogen | 12-321-D | |
| EasySep | Stemcell Technologies | 18000 | |
| EasySep | Stem cell Technologies | 19851 | |
| tampone FACS | BD | BDB554657 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Corning | MT35011CV | |
| GlutaMAX | Gibco | 35-050-061 | |
| G-Rex6 | Wilson Wolf | 80240M | |
| Soluzione tampone HEPES | Gibco | 15-630-080 | |
| IL-15 ricombinante umano | Miltenyi Biotec | 130-095-765 | |
| IL-2 ricombinante umano | Miltenyi Biotec | 130-097-748 | |
| IL-7 ricombinante umano | Miltenyi Biotec | 130-095-363 | |
| Lipofectamine 3000 | Invitrogen | L3000008 | |
| MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali | Gibco | 11140-050 | |
| Topo Anti-CD3 BV421 | Biolegend | 100228 | |
| Topo Anti-CD3/CD28 Dynabeads | Gibco | 11-453-D | |
| Topo Anti-CD4 BV605 | BD | 563151 | |
| Topo Anti-CD44 APC | Biolegend | 103011 | |
| Mouse Anti-CD62L PE-Cy7 | Tonbo | SKU 60-0621-U025 | |
| Topo Anti-CD8 APC-Cy7 | Tonbo | SKU 25-0081-U025 | |
| Nikon Ti2 con fotocamera Prime 95B | Nikon | ||
| Piastre a 24 pozzetti non trattate | CytoOne | CC7672-7524 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31-985-062 | |
| pCL-Eco | Addgene | #12371 | |
| Soluzione di penicillina/streptomicina | Gibco | 15-070-063 | |
| Phoenix Eco cells | ATCC | CRL-3214 | |
| pMDG.2 | Addgene | #12259 | |
| pMSCV_PGK_GFP28z | N/A | Prodotto da R.LV. | |
| SFGFP | Purificato n/A | Prodotto da R.LV. | |
| RetroNectina ('reagente di trasduzione') | Takara Bio | T100B | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875 | |
| Pipetta sierologica 10 mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Pipetta sierologica 25 mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
| Pipetta sierologica 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| Piruvato di sodio | Gibco | 11-360-070 | |
| piastre a 24 pozzetti trattate con TC | Corning | 08-772-1 | |
| Tripan blu | Gibco | 15-250-061 |
Riferimenti
- June, C. H., Sadelain, M. Chimeric antigen receptor therapy. N Engl J Med. 379 (1), 64-73 (2018).
- Duncan, B. B., Dunbar, C. E., Ishii, K. Applying a clinical lens to animal models of car-t cell therapies. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 17-31 (2022).
- Hou, A. J., Chen,....
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Ristampe e permessi
